目的基因的分离和克隆

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1、第四章目的基因的分离和克隆第一节目的基因的获得第二节获得目的基因方法的选择第三节目的基因重组体的构建第一节目的基因的获得一、化学合成二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因三、建立基因组DNA文库四、构建cDNA文库筛选目的基因五、其他方法一、化学合成法自动化DNA合成仪1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列2）较短的DNA片段，有专一性和定向性2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余

2、的反应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。应用范围：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探针3）人工接头及较小的基因二、建立基因组DNA文库基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体。1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及

3、重复序列的数量分布及大小2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）⑴分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色体DNA⑵制备全部基因组的DNA片断①机械断裂法用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用②限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。⑶DNA片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒λ噬菌体酵母人工染色体①基因组DNA+粘性质粒——重组DNA——转化细菌菌落②基因组DNA+λ噬菌体

4、——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。基因组文库大小的计算1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1－P）N=———————In（1－f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？In（1－0.99）N=————

5、———————————=9.2×106In（1－1.5×103／3×109）若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDN

6、A104～106转化子／μgDNA～500转化子／μgDNA表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较四、构建cDNA文库cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。特点：cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）可在原核细胞中表达有生物活性蛋白不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同不能研究基因组的结构功能构建cDNA文库

7、1.制备mRNA1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料2)从总的RNA中分离mRNA将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[oligo(dT)]纤维素中进行亲和层析2.第一股cDNA合成1）以Oligo(dT)为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA2）随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长c

8、DNA第一链（RNA-DNA）3.第二股cDNA的合成⑴自身引导法：⑵置换合成法⑶外加引物合成法4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞(如图4-5)筛选目的基因⑴核酸杂交法特殊标记的寡核苷酸链为探针将扩增好的