《目的基因的克隆》PPT课件

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1、基因克隆的一般流程基因的获得PCRRT-PCR载体连接准备感受态细胞转化重组子筛选下游工作载体的选择基因工程载体一般要求：能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。易进入宿主细胞，进入效率越高越好。合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作。有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等重组DNA技术的一般流程目的DNA的获得目的DNA与载体的连接重组子导入受体细胞重组子的筛选和鉴定实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建

2、NGF基因的克隆(T-A克隆)NGF-sense:aGAGCTCaagatgctgtgcctcaagccagtNGF-antisense:atGGGCCCgtctagatccagagtgtctg56pEGFP荧光质粒表达载体质粒DNA的酶切反应结果质粒M酶切反应M酶切反应pEGFPpT-NGF酶切产物凝胶回收操作步骤（GelExtractionKit）仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟，使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒

3、，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱中加入500lW1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1分钟，9000g×1分钟。备用。重组子的筛选耐药性基因外源质粒赋予宿主抗生素抗性蓝白斑筛选（互补现象）lacZ＋plasmid和M15△cellstrain关于连接酶定义：ATP存在下，在3’OH和5’P之间形成磷酸二酯键。特性：连接粘端的效率远高于平端。策略：首选不匹配粘端次选匹配粘端，载体脱磷平端

4、连接，延长时间，提高酶量平端连接图示匹配粘端连接图示不匹配粘端连接图示连接反应的建立连接反应的温度：粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。如PstI（CTGCA↓G，12℃），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃，酶的用量要比粘性末端加大10-100倍。DNA量：摩尔数之比载体:目的DNA＝1:(1~3)载体摩尔数目标基因片段碱基数×载体重量目标DNA摩尔数目标基因片段重量×载体碱基数载体和目标基因的连接反应如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与目的基因摩尔数比1:3进行连接。连接反应在灭菌的0.5ml

5、离心管中进行。15l体积反应体系中：加ddH2O使终体积为15lLinervector50-100ngTargetgenefragment15-30ng10×LigaseBuffer(已含有ATP)1.5lT4DNALigase1.Ol轻轻混匀，稍加离心,14-16℃或4℃,O/N。重组子转入受体细胞体外重组的DNA引入受体细胞感受态:受体细胞处于易于接受外源DNA的状态原理:（1）遗传物质的传递（2）受体菌的选择与改造重组质粒的酶切鉴定重组子的鉴定插入片段长度大小鉴定质粒抽提、酶切；PCR插入片段方向性鉴定可以选择基因内部切点进行不对称酶切DNA序列测定荧光质粒转染观察