目的基因的制备和基因克隆的筛选ppt培训课件

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1、基因工程田长恩Tel:13342886615基因工程1基因工程概论2天然DNA的制备3分子克隆工具酶4分子克隆载体5表达载体6PCR技术及其应用7目的基因的制备8基因克隆的筛选策略9细菌基因工程10酵母基因工程11植物基因工程12动物基因工程13医药基因工程14基因工程的安全Howtoamplifyatargetgene?AmplificationofatargetgenewithPCRifthesequenceisknown.7目的基因的制备7.1直接分离7.2构建基因组文库分离7.3构建cDNA基因文库分离7.4利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因7.5基因的化学合成(自学)

2、7.1直接分离限制酶酶切分离法适于从简单基因组分离目的基因，如质粒和病毒。①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段即可。②对定位的目的基因，根据目的基因两侧的已知限制酶识别位点，用适当酶切割，可获得目的基因。③即使含目的基因的DNA分子未定序或未定位，先通过酶切分析，随后再通过部分酶切，克隆构建一个非常简单的基因组文库，从中钓出目的基因。2）物理化学法如果不同DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等明显不同，采用相应的方法从生物基因组分离目的基因。主要有密度梯度离心法、单链酶解法和分子杂交法等。①密度梯度离心

3、法：GC含量高，浮力密度大，可用密度梯度超速离心使片段分开。然后通过与标记的mRNA杂交检验，分离基因，如非洲爪蟾rDNA和海胆组蛋白基因。②单链酶解法：GC含量高，Tm值就高。据此，可通过控制Tm使富AT区变性解链，而富GC区仍维持双链状态，然后利用单链核酸酶S1酶切除单链，得到富GC的片段，经梯度离心分离。海胆rDNA分子内GC含量高达63％，就是用此法分离得到。③分子杂交法：单链DNA与其互补的序列“配对成双”后，再将非单链用单链核酸酶S1切掉，最后经梯度离心分离。Beckwith(1969)等应用此法，成功地分离了大肠杆菌乳糖操纵子的β-半乳糖苷酶基因，首创了单基因分离的成功

4、先例。3）双抗体免疫法此法适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白质。黄色葡萄球菌中的proteinA可以同IgG产生免疫反应而代替第二抗体，由此发展出用proteinA-Sepharose4B作为亲和层析介质，通过亲和层析分离特定的多聚核糖体的技术，从而使双抗免疫法更有效。多聚核糖体制备与一抗保温多聚核糖体-一抗特定mRNA不连续蔗糖梯度离心多聚核糖体-一抗体-二抗纯化的多聚核糖体-一抗体-二抗去除蛋白cDNA4)反转录法对于特定基因，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段。这样就可以通过mRNA-cDNA-dscDNA的途

5、径而绕过建立cDNA文库这一步，直接得到基因。7.2构建基因组文库分离法(第11章)高等生物的基因组DNA十分庞大，可达数万个，且基因组成结构复杂，因此，单个基因在整个基因组中所占的比例极小，除少数外，绝大多数基因难以直接分离。解决以上难题的一种可行方法就是扩增这个基因，以增加分离成功的可能性。但要分离的目的基因往往是未知基因，无法进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再用不同的方法将所需的克隆筛选出来，再分离得到目的基因。鸟枪法克隆目的基因早期方法，先将DNA打断，与适当载体重组，转化受体菌进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克

6、隆，再从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，获得所要的基因。鸟枪法的不足：采用质粒作载体，克隆能力有限，重组后的克隆多，筛选困难。噬菌体载体使可插入的外源片段长度大为增加，最大可达22kb；而cosmid和YAC载体能容纳45kb和上百万kb，有利于分离和筛选同一生物体内的各种基因片段。1)基因组文库的概念通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受体菌的群体，即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，则称为部分基因组文库。2）基因组文库的大小理想的基因组文库：“全”，克隆群体包含基因组的所有DNA序列；“完整”，片段的长度要足够，

7、含基因的完整序列，包括其侧翼序列；“重叠”，目的序列在某些克隆中有部分重叠，便于获得基因的全部序列。一般情况下，完整的基因组文库所需的克隆总数取决于外源基因组大小及切割片段大小，可用公式进行理论值的估算：基因组文库的克隆数目=基因组DNA总长／片段均长例如某生物基因组的总长为3×106kb，酶切片段均长15kb，则基因组文库应含克隆子数为3×106／15＝2×105。但实际上,该基因组文库应含的克隆子数远远超过这个数。为此，Clark和Carbon(197