目的基因的克隆—PCR法扩增目的基因片断.ppt

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1、目的基因的克隆—PCR法扩增目的基因片断PCR(PolymeraseChainReaction)，聚合酶链式反应,模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程DNA的结构（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脱氧核糖核苷dNTP三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTPDNA的结构（2）A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶五种碱基A-TC-GDNA的结构（3）氢键维持了DNA的双螺旋结构DNA的复制（1）3’-OH进攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5‘->3’DNA的复制（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一

2、步解开双链DNADNA的复制（3）DNA的复制和体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入打开双链解链酶加热变性维持单链单链结合蛋白高温引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—退火PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR整个过程讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板防止非特异性的引物退火延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚

3、合酶常规用的PCRDNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在1000C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在720C左右。讨论2：影响PCR质量的一些因素模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。酶：纯度、可信度，碱基错配率<1/10

4、000。讨论3：PCR的应用从蓝藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品基因库检索SOD的序列设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白讨论3：PCR的应用检测粉末样品是否含有炭疽杆菌炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤

5、培养2小时取培养液直接作PCR讨论3：PCR的应用基因测序基因组计划首要任务就是测序Sanger双脱氧法ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光讨论3：PCR的应用基因测序实验步骤：1.取一个干净PCR专用小管2.往PCR管里面加入各种试剂3.设定好机器各种参数4.开始PCR5.电泳检测PCR结果无菌去离子水34ul10XPCR缓冲液5uldNTP混合液4ulMg++溶液3ul引物11ul引物21ul模板基因组DNA1ulrTag聚合酶1ul