实验六目的基因的pcr扩增

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1、实验六目的基因的PCR扩增一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是一种体外扩增特异DNA片段的技术。二、实验原理二、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性（2）引物退火（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。二、实验原理1、

2、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。5’3’3’5’高温变性低温退火中温延伸不断循环聚合酶链式反应示意图目的片段模板引物对二、实

3、验原理上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C二、实验原理二、实验原理二、实验原理PCR：变性－退火－延伸二、实验原理PCR二、实验原理二、实验原理温度（℃）时间

4、（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。二、实验原理二、实验原理三、实验仪器与试剂1、仪器：PCR热循环仪、台式离心机、微量移液器、吸头、电泳设备等。2、试剂：10xPCRbuffer、dNTPs

5、（25mM）、Taq酶（5u/μl）、引物1和2(10pmol/ul)、模板DNA、ddH2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、等。四、实验步骤1、PCR反应一般在200ul的PCR薄壁管中进行。2、反应体系（25µl）ddH2O18ul10xPCRbuffer（Mg2++）2.5ul模板DNA1uldNTPs（25mM）1ul引物1(10pmol/ul)1ul引物2(10pmol/ul)1ulTaq酶(5U/l)0.5ul25µl3、按下述循环程序进行扩增94℃×3分钟，1个循环94℃

6、×30秒，56℃×30秒，72℃×1分钟，30个循环72℃延伸10分钟4℃保温4、扩增结束后取10μl扩增产物，利用1.2%琼脂糖电泳检测DNA扩增情况四、实验步骤五、实验结果六、PCR反应条件的优化1、温度、循环参数：（1）变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性

7、和dNTP分子造成损害。（2）复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40～60℃，30～60s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55℃30″，足以使引物与模板之间完全结合。六、PCR反应条件的优化六、PCR反应条件的优化（3）延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。引物小于16个核苷酸时

8、，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70～75℃。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，<1Kb，1分钟足够；>1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72℃1′。（4）循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反