实验三PCR扩增制备目的基因.doc

《实验三PCR扩增制备目的基因.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、反转录概念　　   反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。区分:反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。2 反转录酶与反转录过程　　   反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RN

2、A为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。　　   大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。　　   ①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录

3、酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。　　   ②RNaseH活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。　　   ③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。　　    除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一

4、种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNAlibrary)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。　　反转录的简要过程表示如下：　　   反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementaryDNA,cDNA)，它与

5、RNA模板形成RNADNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。3 生物学意义　　反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。　　（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某

6、些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）。有些病毒（如阮病毒，即疯牛病病毒）以蛋白质直接形成蛋白质。　　（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。RNA反转为cDNA10μl体系mix2μlRNA500ngAddto10μ

7、lPCR程序37℃10min85℃5s稀释产物即可用于后续实验。实验三PCR扩增制备目的基因1．目的学会PCR操作的基本技术。2．原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4

8、．试剂3U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌ddwater。5．实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭