目的基因的分离1

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1、第六节目的基因的获得（基因克隆）一、目的基因定义：基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物质（品系），为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的相关基因，这样的基因通常称之为目的基因，目的基因主要是结构基因。目的基因可以是完整的基因（包括转录启动子、基因编码区和转录终止子），也可以是基因的部分片断。二、结构基因的组成作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子。启动子：是DNA上RNA聚合酶识别、结合和促进转录的一段核苷酸序列。基因编码区：包括起译码ATG、

2、开放阅读框和休止码TAA(TAG、TGA).终止子：是一个能提供转录停止信息的核苷酸序列。原核生物结构基因的组成编码区：原核生物的基因多数以操作子形式存在，完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子。原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区，一般为AGGA,由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置，核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG.启动子：原核生物的启动子含－35序列保守区5‘TTGACA3’提供RNA聚合酶识别的信号；－10序列

3、保守区5‘TATAAT3’，DNA双链从此解开双链转录。操纵子除了启动子以外，还有一些调控转录的其他因子，如调节因子和操纵因子等.终止子：原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。真核生物结构基因的组成基因编码区：真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区（内含子）；启动子：真核生物结构基因的启动子通常包含3个保守序列区：在－20至－30序列区有一个TATA框，DNA双链在此处开始解开；在－75序列区有一个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更

4、上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列；终止子：高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号；真核生物染色图基因组的结构基因不具有SD序列区，核糖体与转录的mRNA的结合靠mRNA5’端添加的“帽”结构；其他类型基因组的基因组成质粒基因组病毒（噬菌体）基因组线粒体基因叶绿体基因组三、目的基因的分离方法1.PCR技术获取目的基因反转录PCR反转录PCR，即RT－PCR（ReverseTranscriptionPCR），是将逆转录与PCR相结合的技术。可分为两步：逆转录：引物可以是Ol

5、igo(dT)12-18或基因特异引物，模板是总RNA或mRNA；PCR：以mRNA逆转录合成cDNA第一条链为模板，引物用基因特异引物或从蛋白质序列设计的简并引物群以及Oligo(dT)12-18等。已知目的基因序列的RT-PCR根据目的基因的编码区序列两侧设计正反引物，一个是逆转录引物作为反义引物，另一个是基因特异正向引物，两个引物必须保证能扩增出基因的编码区序列。已知目的基因蛋白产物的N端部分氨基酸序列信息时，就可以以此设计特异引物，RNA从中通过RT-PCR获得目的基因。首先Oligo(dT)12-18反转录第一链，接着

6、以N端部分氨基酸序列反推的简并引物为正向引物，Oligo(dT)12-18为反向引物进行扩增。从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCR依据部分序列信息获得基因全长序列如果获得的目的基因的DNA片断是不完整的，那么基因有必要根据已知的序列获得目的基因全长的序列。目的基因完整序列的获得对基因结构分析、蛋白表达及基因功能的研究至关重要。反向PCR反向PCR是一种根据已知DNA区的序列设计引物，以包含已知区和未知区的环化DNA分子为模板来扩增未知DNA区序列的PCR技术；首先提取基因组DNA，用一种在已知DNA区没有识别位点的限制酶切

7、割，产生含上、下游未知区域DNA片断，然后通过T4DNA连接酶处理形成首尾相连的双链环状DNA。根据已知区域设计两套巢式引物即外测引物S1、A1和内侧引物S2、A2进行巢式PCR，获得特异PCR产物。测序后获得已知序列。较小的环化DNA分子，扩增效率高。盒式PCR盒式PCR是利用cassette（人工合成的带有适当限制性酶的黏性末端较长的双链DNA分子）盒cassette上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的限制酶切，产生含上、下游未知区域DNA分子然后与含有对应限

8、制酶切位点的cassette进行连接。接着用cassette引物1（C1）盒根据已知区域设计的特异反向引物1(ASP1)配对，cassette引物2（C2）和根据已知区域设计的特异反向引物2(antisenseprimer2,ASP2)配对,进行巢式PCR来扩增