张基因工程制药目的基因的分离

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1、目的基因的分离1分离目的基因的方法及原理目的基因分离方法的选择原则目的基因的序列测定本节内容2目的基因的定义：targetgene对基因组中某一基因成分或该基因片段进行研究或应用，首先需要通过克隆、扩增以获得该基因，此基因（或片段）称为目的基因。外源性基因（或DNA）：clonedDNAinvitro插入至载体、并导入宿主细胞内复制的基因。第一节分离目的基因的方法及原理13DNA重组技术：按照人的意愿在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。4目的基因的来源从庞大的基因群中获得某一目的基因的DNA片段要求①纯度高；②数量多原核细

2、胞（较易获得目的基因）基因组较小，可直接分离获得基因组限制性内切酶水解成若干片段探针筛选提纯扩增56真核生物：一个单拷贝基因仅占整个基因组的10-5甚至更少，不易获得。真核细胞目的基因的来源根据不同要求选择1.构建cDNA文库2.构建基因组文库3.人工合成SynthesizeDNAinvitro4.PCR扩增7DNA文库：通过重组、克隆保存在宿主细胞中的各种DNA分子的集合体。文库保存了该种生物的全部遗传信息，需要时可从中分离获得。1.cDNA文库——只包括表达成蛋白质的DNA序列2.基因组文库——代表该种生物体所有的DNA序列8cDNA(互补DNA,complementaryDNA)区域特异

3、性cDNA文库从特定位点的基因组DNA出发寻找转录序列即以含有某种人染色体或其区段的杂交细胞株分离RNA,反转录合成cDNA分类:用人特异性Alu序列扩增，寻找外显子，可以得到染色体段内表达基因的分布图9组织特异性cDNA文库从cDNA出发寻找转录序列，将其定位于遗传图谱或物理图谱上。即以不同发育阶段的人组织细胞为材料，提取RNA，构成cDNA文库。可得到特定细胞的外显子图谱10一、构建cDNA文库cDNA以mRNA为模板经逆转录而成，故须选择mRNA丰富、较易获得的、目的基因表达活跃的组织细胞为材料。111.真核细胞mRNA的分离和纯化提取细胞内总RNA分离和纯化mRNAmRNA3’端有po

4、lyA尾，用oligo-dT纤维素亲和柱分离纯化mRNA。12132.逆转录合成cDNAcDNA第一链合成14cDNA第一链合成的注意事项合成效率低cDNA长度应为0.7-8kb各种反转录酶只能存于-20℃，不可-70℃15方法Ⅰ：①合成cDNA第一链5’~~~~~~~~~~~~~~~~~~AAAAAA3’mRNATTTTTTT5’cDNA1Oligo(dT)，反转录酶dNTP,②合成cDNA第二链~~~~~~~~~AAAAAA3’cDNA2TTTTTTT5’RNaseH，DNA聚合酶,dNTP5’AAAAAA3’双链cDNA3’TTTTTTT5’16Poly（T）引物反转录酶降解RNADNA

5、聚合酶S1酶去除发夹发夹cDNA第二链合成方法：自身引导法第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA单链cDNA分子的3’末端自身环化，形成发夹结构以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二链缺点：S1核酸酶17置换合成法焦磷酸钠存在下合成cDNA的第一链RNAaseH酶降解RNARNA链上出现切口产生一系列带3’-OH的RNA引物大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链18PCR法193.构建cDNA文库（1）修饰cDNA两端接头：人工合成的双链寡核苷酸，二端均为平头或含酶切位点。衔接头：一端为平头，一端为粘末端。20（2）cDNA与载体相连各cDNA各自与一个载体在T4连接

6、酶作用下以粘末端互相连接，即为重组DNA分子。21（3）导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存。宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状相同。224.筛选目的基因核酸杂交法：cDNA克隆（菌斑或噬菌斑）硝酸纤维素膜杂交（DNA探针）显影定位挑选培养扩增纯化2324252326二、构建基因组文库1.分离纯化基因组DNA条件应温和，以保证得到较长的DNA链2.DNA片段与载体连接基因组DNA酶水解具一定长度的片段（粘性末端）载体（噬菌体等）酶解与目的基因连接273.导入宿主细胞：携带基因组DNA片段的噬菌体或粘粒经包装后转入宿主细胞内培养扩增。插入基因组片段的集合体即

7、基因组文库。284.筛选目的基因原核细胞不可用来作为基因的表达系统（无转录后加工）。原核细胞基因库——只能用核酸探针杂交筛选目的基因。29三、人工合成目的基因DNA片段1.DNA的化学合成2.DNA的酶促合成（首先需要有目的基因DNA或与之互补的RNA链作为模板）30四、聚合酶链反应合成DNA片段（见PCR章）431五、其他方法1.构建差示文库(differentiallibrary)差示文库：反