目的基因的获取.ppt

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1、重组DNA基本技术原理（一）目的基因获得（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（DNA连接酶）（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选（六）克隆基因的表达第五章目的基因的获取把需要研究的基因称为目的基因（靶基因或者插入基因）。要分离、改造、扩增或表达的基因。目的基因：如：生长激素基因、干扰素基因等。就是几千个或几百个甚至更少的碱基对的DNA片段。生物种类人拟南芥果蝇水稻蠕虫流感病毒基因数目（万个）3~42.551.3651.780.175单个gene在整个基因组中所占的比例极其微小，加上复杂的基因间序列；对单个目的gene的分离如同大海捞针。已知基因的获取

2、方法：⒈PCR技术扩增目的基因⒉化学方法人工合成目的基因未知基因的获得途径：⒈构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因2.构建cDNA文库，筛选目的基因3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因4.酵母双杂交体内鉴定基因本章内容第一节基因组DNA的片断化第二节基因的化学合成第三节目的基因的保存和扩增第四节目的基因的分离和扩增第一节基因组DNA的片断化二、限制性内切酶消化法一、机械切割法一.机械切割法（1）超声波断裂成约300bp的随机片断（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断（3）移液器抽吸法二、限制性内切酶消化法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片

3、断。酶切基因组DNA1.优点如果带有粘性末端，产物可以直接与载体连接，连接效率高2.缺点①目的基因内部可能有内切酶的切点BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！②消化的片断分子量太大或太小不符合载体容量，不能克隆解决的办法采用随机片断化制备DNA的克隆片断3.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶平均每4096（46）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每256（44）bp一个切点随机程度高。如HaeⅢ、AluI、M

4、obI、Sau3AI②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’1967年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在Science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节基因的化学合成一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法①保护dNTP的5’或3’端-OH③脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保护的单核苷酸连接（缩合）保证合成反应的定向进行，防止两个末端之间形成磷酸二酯键带5’保护的单核苷酸上的3’-OP与另一个带3’保护的单核苷酸的5’-O

5、H以磷酸二酯键连接起来用酸或碱脱去5’-或3’-保护的连接起来的多聚核苷酸（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸的5’-OH聚合缩合保护基团原理与磷酸二酯法一样，只是参加反应的单核苷酸都是在3’-P和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上,这种载体同样也起到一种3’-末端保护装置的作用固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法固相磷酸三酯合成过程三乙胺化学合成的DNA片断一般在150～200bp以内二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸1.互补连接法预先设计合成的片断

6、之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的用途（2）mRNA的含量很低（3）有些基因比较短，化学合成费用较低（1）待研究的特定基因，其相应的组织特异性的mRNA很难提取（4）由于商业竞争，无法获得已报道的基因克隆时，只能合成。2.合

7、成引物3.合成探针序列合成寡聚核苷酸①根据蛋白质的氨基酸顺序②反推出基因编码区的可能的DNA核苷酸序列③根据合成寡核苷酸混合物作探针，用于筛选特定基因。4.定点突变合成合成一段带有预定突变序列的寡核苷酸片段与野生型的基因序列退火，形成部分异源双链结构通过复制可诱发少量的完整的突变基因经过基因克隆即可获得大量的突变基因5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIBamHI衔接物:指化学合成的一段由