第五章目的基因的获取.ppt

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1、第五章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。需要克隆的DNA片段编码某种蛋白质研究某基因结构和功能的关系研究某基因与疾病的关系目的基因的获取化学合成法基因组DNA文库;cDNA文库聚合酶链式反应直接从染色体DNA中分离第一节基因组DNA片段化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用

2、量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。（3）DNA溶液小孔喷射注

3、射器法可将100kb以上的DNA剪切成10kb左右的片段。1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节化学合成目的基因要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列*化学合成法获取目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。磷酸三酯法、①保护dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保

4、护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图。2.亚磷酸三酯法化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1.互

5、补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA3.

6、合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第三节PCR扩增获得目的基因以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在累述。PCR可以把指定的基因片段数量放大染色体PCR基因放大连琐反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)第四节从基因文库、cDNA文库获取目的基因一、基因文库的构建1.基因文库（genelib

7、rary）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，因此，称之为基因组文库（genomiclibrary）或基因文库（genelibrary）。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直

8、接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbB