豹纹鳃棘鲈病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究.pdf

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1、第4；卷第5期2015年5月中国海洋大学学报PERl0DICAI。0F()CEANUNIVERSITYOFCHINA45(5)：039～045May，2015豹纹鳃棘鲈病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究+姚学良，徐晓丽，张振奎，丁子元，宋昀鹏，崔宽宽(天津市水产技术推广站，天津300221)摘要：从患病的豹纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)的肾脏中分离到1株优势菌33002，人工感染试验证实其对豹纹鳃棘鲈有较强的致病性；采用形态学观察、生理生化特性分析及16SrRNA和gyrB基因序列系统发育树分析对菌株33002进行鉴定。结果

2、显示，菌株33002为革兰氏阴性弧菌，生化特性与利斯顿氏菌属的鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)相近，基于gyrB基因序列的系统发育分析，菌株33002与鳗利斯顿氏菌聚为一支。对48种抗生素的药敏结果显示，菌株33002对红霉素、阿奇霉素等25种药物敏感，对恩诺沙星、杆菌肽等22种药物不敏感。关键词：豹纹鳃棘鲈；鳗利斯顿氏菌；生理生化特性；16SrRNA；gyrB中图法分类号：$941．42+9文献标志码：A文章编号：1672—5174(2015)05—039—07DOI：10．16441／j．cnki．hdxb．20140040豹

3、纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)俗称东星斑、花斑刺鳃脂、豹绘，隶属鲈形目(Perciformes)、熊科(Serranidae)、鳃棘鲈属(Plectropomus)，主要分布于西太平洋至印度洋海区，北自日本南部，南至澳洲，东自斐济，西到非洲东岸、红海等地。豹纹鳃棘鲈肉质鲜美，含有二十几种人体所需微量元素及维生素，营养价值高，价格昂贵，在国际市场上深受欢迎，市场前景广阔。随着豹纹鳃棘鲈人工繁殖技术的突破，该鱼已成为南方沿海特别是海南沿海的后备养殖品种，并由南向北扩展。由于豹纹鳃棘鲈养殖历史短，针对该鱼的研究报道较少，多集中于对其人工繁

4、育及胚胎发育、环境因子对幼鱼的生长影响等研究L1。3]，在疾病方面鲜有报道。鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)是水产养殖动物中常见且重要的病原菌，已知能够感染50多种海淡水养殖动物，给水产养殖业带来严重危害[4与]。本研究从患病豹纹鳃棘鲈肾脏分离到病原菌，经鉴定为鳗利斯顿氏菌，对其进行理化特性、致病性、抗菌药物敏感性及16SrRNA基因与gyrB基因系统发育分析，丰富了鳗利斯顿氏菌的相关研究资料，并为豹纹鳃棘鲈细菌性疾病的检测及防治提供参考。1材料与方法1．1材料患病豹纹鳃棘鲈取白天津盛亿水产养殖有限公司，体质量25～35g，人工感

5、染用健康豹纹鳃棘鲈购自天津市海发海珍品股份有限公司，体质量(27±3)g，暂养1周后用于人工感染实验，饲养期间采用充气泵增氧，每日投饵2次，吸污1次，换水1／2，保持实验期间水温20℃，盐度25。2216E琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、细菌微量生化反应管及细菌药敏纸片等均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1．2细菌分离无菌条件抽取有明显症状的豹纹鳃棘鲈腹水滴片进行革兰氏染色，观察细菌典型形态，从病鱼肾脏中分离细菌，分别划线接种于2216E琼脂、TCBS培养基上，于28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进一步纯化，获得纯培养的菌株，转接于TSB液体

6、培养基中培养24h，加15％甘油于--80℃冰箱中保存。1．3人工感染实验将纯培养菌接种于TSB培养基，28℃培养过夜，0．85％NaCl洗涤3次，菌悬液浓度调至3×107cfu／mL做为供试菌液，待用。感染实验分2组，每组6尾豹纹鳃棘鲈。试验组腹腔接种供试菌液，每尾0．2mL；对照组注射等量0．85％NaCl；每天观察记录实验鱼感染后的发病及死亡情况，期间每天正常饲养并换水，并取症状典型的实验鱼再次进行细菌分离鉴定。以引起试验鱼发病死亡并能重新分离到感染菌作为分离菌致病与否的判定指标。1．4细菌鉴定1．4．1形态与茵落特征观察及理化特性检查取纯*基金项目

7、：天津市科技支撑计划项目(12ZCZDNC00900)资助收稿日期：2014—03—02；修订日期：20140912作者简介：姚学良(1982一)．女。硕士，工程师，主要从事水产动物病害防治及水产养殖技术的研究和推广工作。Email：tjyaoxueliang：@126．corn中国海洋大学学报培养菌接种于2216E琼脂于28℃培养20h，制备涂片标本进行革兰氏染色观察细菌形态特征；参照《常见细菌系统鉴定手册》和《人及动物病原细菌学》[6。7]进行细菌氧化酶、糖(醇及苷)类代谢、H。S、吲哚、甲基红、V_P试验、硝酸盐还原、枸橼酸盐利用等理化特性测定。1．

8、4．216SrRNA和gyrB基因序列测定与系统发育分析PCR模板