斯顿氏菌的分离鉴定及其系统发育研究

《斯顿氏菌的分离鉴定及其系统发育研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、}’_，‘lI^、1‘答辩委员会主席：座雪莲教援(遏划太堂)答辩委员会成员：选锦玉丛窒员(逝江鲞遗坐丞芒丛究逝)论文答辩日期：2010年5月23日2EBTCBSbpEDTAPBSKCNEthidiumBromide溴化乙锭ThiosulfateCitrateBileSaltsSucrose弧菌科细菌分离AgarCultureMedium培养基Basepair碱基对EthylenedliamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸PhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲盐水

2、PotassiumCyanideONPG’0一Nitrophenyl—p-D—galactopyranosideVPMRLPSVoges—ProskauerTestMethylRedTestT●●‘-一Llpopolysaccharide氰化钾邻硝基酚13-D．半乳糖昔VP试验甲基红实验脂多糖16SrRNA16SRibosomalRNA16S核糖体RNA_-—__————_-_-—___-_-__———__----—_—__-一一l_温州医学院硕士学位论文香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及其系统发育研

3、究中文摘要目的分离鉴定香鱼(Plecoglossusaltivelis)出溃烂病致病菌，通过分析致病菌耐药性和人工感染香鱼组织病理学变化，为香鱼细菌性疾病的诊断和生产安全用药提供理论基础。采用生理生化鉴定的方法及采用多位点持家基因序列作为分子标记，研究致病菌的系统分类学地位，旨在为香鱼细菌性疾病的防治提供参考，并为微生物的分子生物学鉴定提供新思路。方法1．分离纯化人工养殖过程中香鱼溃烂病的致病菌。2．分析致病菌的耐药性和致病菌感染香鱼后引起的肝脏、肾脏和肠组织病理学变化。。3．通过微生物生理生化

4、特征鉴定致病菌的种类。4．利用PrimerPremier5．0软件设计致病菌rpoB、ftsZ、topA等持家基因的特异性引物，扩增目的片段并进行序列测定。5．采用CiustalX、MEGA4，0软件对不I司物种的持家基凶的DNA序列或氨基酸序列进行比对构建进化树，研究致病菌的系统分类学地位。结果1．2008分离得到4株致病菌(编号：X01．x04)；2009年得到1l株致病菌(编号：X0901一X0911)，接种于冻存管中，于．20℃保存。2．测定了致病菌对常用渔药的药物敏感性，该致病菌对复方

5、新诺明、利福平、恩诺沙星、新霉素和呋喃妥等药物敏感。3．患病香鱼的肝脏、肾脏和肠组织结构与健康香鱼的组织结构相比发生明显的变化。肝脏细胞结构不完整，部分溶解，形成大量细胞碎片，结构松散，出现有大量的空泡；肾脏细胞完整性被破坏，肾小管结构被破坏。肾小管上皮细胞与周围的组织分离，只留下肾小管的轮廓，肾问质条索状，肾小球部分坏死，中心呈淡红色无结构物质；小肠上皮组织发生大面积溃烂，小肠绒毛及内壁褶皱均已被破坏，小肠绒毛脱落，小肠上皮细胞坏死脱落裂解，肠腔内可以看到大量的脱落坏死浓缩后的细胞碎片。4．通

6、过对致病菌的生理生化特征鉴定可知其氧化酶阳性、接触酶阳性、甘露醇阳性、吲哚阳性、硝酸盐还原阳性、MR测定阳性、精氨酸脱羧酶阳性、精2十学位论文利用葡萄糖、甘露糖和蔗糖产酸。，rpoB，gapA，topA，hsp60，16SrDNA共10个位点的部分基因片段，并对其中的八个基因的DNA序列和topA氨基酸序列比对，构建系统发育进化树。结论1．引起养殖香鱼出血溃烂病的致病菌为鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)，可以使用复方新诺明、利福平、恩诺沙星、新霉素和呋喃妥等渔药对患病香

7、鱼进行治疗。2．人工感染香鱼短时问内死亡，肝脏、肾脏和肠组织结构发生明显的变化，推测器官功能衰竭可能是患病香鱼迅速死亡的主要原因。3．本实验扩增的toxR目的片段包括有toxR基因、toxS基因部分序列和其中间序列，且其GC含量明显的低于其他基因，说明这部分片段可能存在水平基因转移，不推荐用于弧菌系统发育地位的研究。4．基于atpA、hsp60、gyrB、rpoB、gapA、ftsZ、recA基因序列和topA氨基酸序列的八个基凶树与16SrRNA基凶树的聚类结果基本相同，数据分析表明flsZ、

8、hsp60基冈适合作为弧菌科常见的lO种细菌物种分类研究的分子标记。关键测‘香鱼；鳗利斯顿氏菌：持家基因；组织病理学tobjectivesThepathogensofhemorrhagicsepticemiaandskin—ulcersymptomwereisolatedandidentifiedfromPlecoglossusaltivelis．Thedrug—resistantofpathogenswasanalyzedandthehistopathologicalchangesofAyui