豹纹鳃棘鲈致病性哈维氏弧菌的分离鉴定与系统发育分析-论文.pdf

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1、第33卷第4期华中农业大学学报Vo1．33No．42014年7月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJuly2014．1l2～l18豹纹鳃棘鲈致病性哈维氏弧菌的分离鉴定与系统发育分析徐晓丽邵蓬李灏任涵玮张勤天津市水产技术推广站，天津300221摘要为探明养殖豹纹鳃棘鲈体表溃疡症的病因，从患病豹纹鳃棘鲈血液及内脏、体表溃疡处分离到2株优势菌，其中编号为1031的菌株经人工感染证实能够引起被感染鱼的死亡，为引起该豹纹鳃棘鲈溃疡病的病原菌。采用形态学、生理生化特性鉴定，结果表明菌株103t与弧菌属的基本特征相符，

2、分别基于16SrDNA序列及热激蛋白6O基因(hsp60)序列构建的系统发育树将菌株1031与哈维氏弧菌聚为一支，置信度均为97，以1031为模板特异性扩增哈维氏弧菌toxR基因，也得到了预期382bp的核酸片段。综合以上结果，最终确定此次豹纹鳃棘鲈体表溃疡症的病原为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)。药敏结果显示，该菌株仅对氟苯尼考、庆大霉素(120g)、菌必治敏感，对诺氟沙星、恩诺沙星、阿奇霉素、强力霉素等均不敏感。关键词哈维氏弧菌；豹纹鳃棘鲈；16SrDNA；hsp60；to3cR中图分类号S941．4文献标识码A文章编号1000—24

3、21(2014)040112—07豹纹鳃棘鲈(Plectropomusleopardus)又名花鉴定，筛选病原的敏感药物，以揭示诱发该病的病斑刺鳃铂、七星斑、东星斑等，属鲈形目、储科、石斑原，并为该病的有效防治提供依据。鱼亚科、鳃棘鲈属，主要分布于印度洋、太平洋的热1材料与方法带海域，在海南东岸和南部海域也有少量分布。该鱼肉质鲜美，营养丰富，含有20余种人体所需微量1．1试验鱼来源元素及维生素，具很高的营养价值，且价格昂贵，市患病豹纹鳃棘鲈取自天津盛亿水产养殖有限公场空间广阔。豹纹鳃棘鲈主要栖息于珊瑚礁区，过司，病鱼体长10～15cm，体质量2O～

4、30g，养殖水去多依赖于从国外进口海洋捕捞的商品鱼，2009年温2O℃。感染试验用健康豹纹鳃棘鲈购白天津海海南水产研究所及中国水产科学院南海水产研究所发海珍品股份有限公司，体长(13±3)cm，体质量先后成功繁育出豹纹鳃棘鲈鱼苗，成为我国海水养(29±3)g，于6OL水族箱中暂养1周后用于试验。殖新品种。目前，该鱼主要在台湾、香港、海南、广饲养期间充气泵增氧，Ft投饵2次，每日吸污，换水东、福建及山东沿海地区养殖，2012年豹纹鳃棘鲈1／2，保持水温20℃，盐度1．5。在天津试养成功，正逐渐成为天津工厂化海水养殖1．2病鱼检查及细菌分离培养的又一优

5、良鱼种。取濒死病鱼与正常鱼同时对其体表及内部解剖豹纹鳃棘鲈的人工育苗虽已成功，但还未能满病理进行观察比较，确定该病的典型症状。取症状足大规模养殖的需要。目前，对豹纹鳃棘鲈的研究明显的患病豹纹鳃棘鲈鳃、体表粘液及患病组织在多集中于苗种人工繁育技术的完善、生殖调控技术显微镜下排查寄生虫和真菌。抽取病鱼血液制作血及生态因子如温度、盐度、光照等对其孵化、仔鱼成涂片染色观察，同时在无菌条件下从病鱼的血液、腹活和生长的影响_】j。本研究针对天津市某工厂化水、脾、肾、体表上分离细菌，划线接种于TCBS平养殖园区豹纹鳃棘鲈出现腹水、体表皮肤溃疡进而板、2216E平

6、板及血平板上，于28℃恒温培养24h，大批量死亡的具体情况，取患病鱼体进行病原分离、挑取形态一致的优势菌落再次划线分离，纯化获得收稿日期：2o13一O9O3基金项目：天津市科技支撑计划项目(12ZCzDNCO090O)徐晓丽，工程师．研究方向：水产动物病害与免疫学．Email：xiaolixu1983@gmaii．COrn通信作者：张勤，研究员．研究方向：水产养殖技术．E-mail：sczhangqin@eyou．corn第4期徐晓丽等：豹纹鳃棘鲈致病性哈维氏弧菌的分离鉴定与系统发育分析113纯培养的菌株，转接到TSB培养基中培养过夜，加列测定。h

7、sp60基因序列的扩增参照李宁求等_5]的2O甘油冻存于-80℃保存备用。方法进行，PCR产物回收后直接送至天津华大基因1．3人工感染试验科技有限公司进行测序。将分离纯化的2株优势菌接种于新鲜的TSB4)分离菌株的PCR鉴定。分离菌株的PCR鉴培养基，28℃培养20h，用无菌0．01mol／L磷酸盐定采用特异性引物扩增哈维氏弧菌toxR基因[6]，扩缓冲液(PBS)调整菌悬液浓度分别为9×10。、9×增结束后取5fLPCR产物进行琼脂糖电泳，观察10、9×10。、9x10、9×10ct：u／mL，用于感染结果。试验。5)16SrDNA和hsp60基

8、因序列分析与系统发感染试验采用腹腔注射的方式进行，取健康豹育树的构建。将测序所得分离菌的16SrDNA和纹鳃棘鲈60尾，分