莽山烙铁头蛇粗毒活性分析及蛋白质组学研究.pdf

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1、学校代码!Q§垒2密学级口丐200814020024莽山烙铁头蛇粗毒活性分析及蛋白质组学研究Biologicalanalysisofthecrudevenom一，_，T‘。’from么向aoermiamangshanenstsanctproteomicsresearch指导教师姓名、职称室!!主生到塾撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年四月ACN乙腈(Acetonitrile)缩写表DMEMDMEM培养基(dulbecco’Smodifiedeagle’Smedium)DRG背根神经节(dorsalrootganglia)DTT二硫苏

2、糖醇(dithiothreit01)IAA碘乙酰胺(Iodoacetamide)删IIIIIIIIIII11．1lY1912431CCAQ一氰基-4-羟基肉桂酸(a．cyano一4一hydroxy—cinnamicacid)C02二氧化碳(carbondioxide)h小时(hour)rain分钟(minute)rpm辕

3、食(roundperminute)TEMED四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine)2-DE二维凝胶电泳(two．dimensionalgelelectrophoresis)HPLC高效液相色谱(

4、highperformanceliquidphasechromatography)RP．HPLC反相液相高效色谱(reversed-phaseliquidhigh—efficiencychromatography)IC50半抑制剂量(inhibitioneffectfor50％ofthetestedsamples)MALDI．TOFMS基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱(matrix．assistedlaser．desorption／ionizationtime—of-flightmassspectrometry)PBS磷酸盐缓冲液(phosp

5、hatebuffersaline)PI等电点(isoelectricpoint)EDTA乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)TFA三氟乙酸(trifluoroaceticacid)BSA牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin)ddH20双蒸水(Doubledistilledwater)ESI—MS电喷雾质谱(Electrosprayionization)HCT离子阱质谱仪(HighCapacityIonTrap)LC液相质谱(Liquidchromotography)PAGE聚丙烯酰胺凝胶电

6、泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis)PMSF苯甲基磺酰氟(Phenylmethansulfonylfluoride)Tris三羟基甲基氨基甲烷[Tris一(hydroxymethyl)aminomethane]p-Ⅷp巯基乙醇(beta-mercaptoethan01)TTX．R河豚毒素不敏感型(tetrodotoxin．resistant)TTX．S河豚毒素敏感型(tetrodotoxin．sensitive)VGSCNav电压门控钠通道(voltage．gatedsodiumchannel)VGPCKv电

7、压门控钾通道(voltage-gatedpotassiumchannel)VGCCCav电压门控钙通道(voltage-gatedcalciumchannel)I—V电流-电压关系(current—voltagerelationship)NGl08．15小鼠神经母细胞瘤X大鼠神经胶质细胞瘤(neuroblastomaxgliomacel1)GRAVY疏水值(grandaverageofhydrophobicity)摘要目的：①分析莽山烙铁头蛇(ZhaoermYamangshanensYs)粗毒的生物学活性以及对粗毒中的蛋白质(或者多肽)进行鉴

8、定和分析。②分离纯化具有生物活性的毒素分子。实验方法：①膜片钳全细胞记录模式下检测莽山烙铁头蛇粗毒对大鼠背根神经节(DRG)细胞上电压门控钠、钾、钙离子通道的影响。②利用分子筛、反相高效液相色谱(I心．肿LC)、MALDI．TOF质谱技术分离纯化粗毒并分析蛇粗毒中的分子量信息(主要分析分子量<10000Da的多肽组分)。⑨利用超滤、双向凝胶电泳(2．DE)、蛋白质点的胶内酶解、两种质谱技术(TOF．O和HCT)以及通过生物信息学处理，鉴定并分析蛇粗毒中的蛋白质信息。测定粗毒的三种酶活力(乙酰胆碱酯酶、酪蛋白水解酶、碱性磷酸酶)。结果：①膜片钳

9、实验表明莽山烙铁头蛇粗毒对大鼠背根神经节细胞上河豚毒素不敏感型(TTX．R)钠电流有抑制作用，且具有浓度依从性，IC50大于l000mg／L，l000mg／L粗毒可