1份生产用中药蛇粗毒的dna分子鉴定

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1、1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定【关键词】蛇粗毒；分子鉴定；线粒体基因；DNA测序　　Abstract：ObjectiveToidentifydriedsnakevenombyPCR.MethodsToextractDNAandsubsequentsequencingofthemitochondrialgenesfromasnakevenomthathadbeenpreservedfornearly7years.ResultsMinimalgenomicDNAcouldbeextractedfromthecrudevenomby

2、thismethod,andfromplifiedsuccessfully.AllthesequencesittedtoNCBIandparedagainsttheirhomologoussequencesintheGenBankdatabase.ConclusionSequencealignmentanalysesapprovedthatNajanajaostprobableoriginalspecie,andthissamplecouldbeconsistedbysomedifferentsubspeciesorhaplotyp

3、es.Thisapproachoffersastraightforethodfordirectandaccurateidentificationofanimalcrudevenoms.　　Key；Molecularidentification；Mitochondrialgene；DNAsequencing　　近年来，有关中药中毒病例的报道为数不少，如中药性肾损害、中药致癌等问题已引起了国内外学者的高度关注。目前，已发现有包括蛇毒（其它如斑蝥、鱼胆、海马和蜈蚣等）在内的近十几种动物类中药均可致肾脏损害［1］。研究发现，导致此类损害的主

4、要原因可分为中药内在属性不明确以及用药方式不恰当两方面。其中决定中药内在属性最基本的因素——即动、植物种属分类，则时常为研究者所忽略，由此带来的后果，如物种命名不规范等，均可导致药品质量不稳定以及毒副作用发生变化等诸多不良后果。以含蛇粗毒类成分的中药为例，研究者在制剂过程当中对药用原料的物种进行准确地鉴定是非常必要的，是决定用药安全的首要环节。为解决以上实际问题，本文成功从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA并对其物种的身份进行了初步地鉴定，同时对可能影响到鉴定效果的一些因素进行了探讨。　　1器材　　1.1材料　　生产用

5、蛇粗毒由中国人民解放军广州军区广州总医院药学部提供（批号：001212），样品采集于200005，由广州市蛇毒研究所经生化鉴定为舟山眼镜蛇（Najanajaatra）粗毒。新鲜毒液经冷冻干燥处理后铝罐密封，置4℃长期储存。　　1.2试剂与仪器　　DP303离心柱型基因组提取试剂盒和DNAMarkerIII（天根生化科技有限公司），2×TaqPCRMasterMix（广州美津生物技术有限公司），PCR产物胶回收纯化试剂盒（北京艾科基因技术有限公司），蛋白酶K（Amresco公司），引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成），dNTPs，

6、PCR缓冲液，rTaqDNA聚合酶和DL15000DNA分子量标记（宝生物工程大连有限公司）。PE-2400型PCR扩增仪（美国PerkinElmers公司），3730-XL型96道毛细管基因分析仪（美国ABI公司），GDS-8000型凝胶成像系统（美国UVP公司）。　　2方法与结果　　2.1蛇粗毒中总DNA的提取　　称取蛇粗毒冻干粉100mg，缓慢倒入已加有3ml超纯水的5ml离心管中，漩涡振荡至完全溶解，室温静置几分钟后，以10000×g离心5min，弃上清液，管底可见少量白色沉淀，将沉淀用适当体积的超纯水重新悬浮，10000×

7、g离心1min。沉淀中总DNA的提取按试剂盒提供的说明书进行并略作修改，主要步骤如下：加200μl的缓冲液GA，用手指轻弹管底使沉淀悬浮，加10μl40mg·ml-1蛋白酶K，56℃孵育30min，加220μl的缓冲液GB，60℃放置10min，再加220μl无水乙醇，将所有溶液加入吸附柱，依次用去蛋白液GD和漂洗液P各引物（见表1）、0.2mM各dNTPs、1×PCR缓冲液和2U的高保真TaqDNA聚合酶。2×TaqPCRMasterMix的使用完全按产品说明书进行。对于蛇粗毒样品，直接加入一定量的洗脱液作为模板，阳性对照为从蛇肌

8、肉组织中提取的总DNA，不足部分以超纯水补足。扩增参数：94℃预变性3min，共循环32～35次，依次为94℃变性30～60s，55～60℃退火60s，72℃延伸60s，最后在72℃延伸补齐5min。取PCR产物5μl用1.0％琼脂糖