1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定.doc

《1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定【摘要】　　目的利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源物种，并对基因组DNA的提取效果及提取过程中需注意的若干问题进行分析和讨论，同时还对若干针对不同长度目的基因扩增引物的使用效果进行验证。方法从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA，并以之为模板进行PCR扩增、测序和序列分析。结果使用该方法可从蛇粗毒中提取得到微量的总DNA，并成功扩增得到0.45～1.18kb不同长度范围的目的片段；测序结果提交NCBI，并与GenBank中的同源序列进行BLAST比对。结

2、论该蛇粗毒样品来自眼镜蛇，且极可能由多个不同的亚种或单倍型所组成。该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定。【关键词】蛇粗毒；分子鉴定；线粒体基因；DNA测序　　Abstract：ObjectiveToidentifydriedsnakevenombyPCR.MethodsToextractDNAandsubsequentsequencingofthemitochondrialgenesfromasnakevenomthathadbeenpreservedfornearly7years

3、.ResultsMinimalgenomicDNAcouldbeextractedfromthecrudevenombythismethod,andfromwhichdifferentlengthoftargetregionsthatrangedwithin0.45～1.18kbwereamplifiedsuccessfully.AllthesequencesweresubmittedtoNCBIandcomparedagainsttheirhomologoussequencesintheGenBan

4、kdatabase.ConclusionSequencealignmentanalysesapprovedthatNajanajawasitsmostprobableoriginalspecie,andthissamplecouldbeconsistedbysomedifferentsubspeciesorhaplotypes.Thisapproachoffersastraightforwardmethodfordirectandaccurateidentificationofanimalcrudev

5、enoms.　　Keywords：Snakecrudevenom；Molecularidentification；Mitochondrialgene；DNAsequencing　　近年来，有关中药中毒病例的报道为数不少，如中药性肾损害、中药致癌等问题已引起了国内外学者的高度关注。目前，已发现有包括蛇毒（其它如斑蝥、鱼胆、海马和蜈蚣等）在内的近十几种动物类中药均可致肾脏损害［1］。研究发现，导致此类损害的主要原因可分为中药内在属性不明确以及用药方式不恰当两方面。其中决定中药内在属性最基本的因素——即动、

6、植物种属分类，则时常为研究者所忽略，由此带来的后果，如物种命名不规范等，均可导致药品质量不稳定以及毒副作用发生变化等诸多不良后果。以含蛇粗毒类成分的中药为例，研究者在制剂过程当中对药用原料的来源物种进行准确地鉴定是非常必要的，是决定用药安全的首要环节。为解决以上实际问题，本文成功从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA并对其来源物种的身份进行了初步地鉴定，同时对可能影响到鉴定效果的一些因素进行了探讨。5　　1器材　　1.1材料　　生产用蛇粗毒由中国人民解放军广州军区广州总医院药学部提供（批号

7、：001212），样品采集于200005，由广州市蛇毒研究所经生化鉴定为舟山眼镜蛇（Najanajaatra）粗毒。新鲜毒液经冷冻干燥处理后铝罐密封，置4℃长期储存。　　1.2试剂与仪器　　DP303离心柱型基因组提取试剂盒和DNAMarkerIII（天根生化科技有限公司），2×TaqPCRMasterMix（广州美津生物技术有限公司），PCR产物胶回收纯化试剂盒（北京艾科基因技术有限公司），蛋白酶K（Amresco公司），引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成），dNTPs，PCR缓冲液，rTaqD

8、NA聚合酶和DL15000DNA分子量标记（宝生物工程大连有限公司）。PE-2400型PCR扩增仪（美国PerkinElmers公司），3730-XL型96道毛细管基因分析仪（美国ABI公司），GDS-8000型凝胶成像系统（美国UVP公司）。　　2方法与结果　　2.1蛇粗毒中总DNA的提取　　称取蛇粗毒冻干粉100mg，缓慢倒入已加有3ml超纯水的5ml离心管中，漩涡振荡至完全溶解，室温静置几分钟后，以10000×g离心5min，弃上清液，管底可见少量