1份生产用中药蛇粗毒的dna分子鉴定论文

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1、1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定论文【摘要】目的利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源物种，并对基因组DNA的提取效果及提取过程中需注意的若干问题进行分析和讨论，同时还对若干针对不同长度目的基因扩增引物的使用效果进行验证。方法从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA，并以之为模板进行PCR扩增、测序和序列分析。结果使用该方法可从蛇粗毒中提取得到微量的总DNA，并成功扩增得到0.45～1.18kb不同长度范围的目的片段；测序结果提交NCBI，并与GenBank中的同源序列进行BLAST比对。结论该蛇粗毒样品来自眼镜蛇，且极可能由多个不同

2、的亚种或单倍型所组成。该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定。【关键词】蛇粗毒；分子鉴定；线粒体基因；DNA测序Abstract：ObjectiveToidentifydriedsnakevenombyPCR.MethodsToextractDNAandsubsequentsequencingofthemitochondrialgenesfromasnakevenomthathadbeenpreservedfornearly7years.ResultsMinimalgenomicDNAcouldbeextractedfromt

3、hecrudevenombythismethod,andfromplifiedsuccessfully.AllthesequencesittedtoNCBIandparedagainsttheirhomologoussequencesintheGenBankdatabase.ConclusionSequencealignmentanalysesapprovedthatNajanajaostprobableoriginalspecie,andthissamplecouldbeconsistedbysomedifferentsubspeciesor

4、haplotypes.Thisapproachoffersastraightforethodfordirectandaccurateidentificationofanimalcrudevenoms.Key；Molecularidentification；Mitochondrialgene；DNAsequencing近年来，有关中药中毒病例的报道为数不少.freelresco公司），引物（北京赛百盛基因技术有限公司合成），dNTPs，PCR缓冲液，rTaqDNA聚合酶和DL15000DNA分子量标记（宝生物工程大连有限公司）。PE-2400型P

5、CR扩增仪（美国PerkinElmers公司），3730-XL型96道毛细管基因分析仪（美国ABI公司），GDS-8000型凝胶成像系统（美国UVP公司）。2方法与结果2.1蛇粗毒中总DNA的提取称取蛇粗毒冻干粉100mg，缓慢倒入已加有3ml超纯水的5ml离心管中，漩涡振荡至完全溶解，室温静置几分钟后，以10000×g离心5min，弃上清液，管底可见少量白色沉淀，将沉淀用适当体积的超纯水重新悬浮，10000×g离心1min。沉淀中总DNA的提取按试剂盒提供的说明书进行并略作修改，主要步骤如下：加200μl的缓冲液GA，用手指轻弹管底使沉淀悬浮

6、，加10μl40mg·ml-1蛋白酶K，56℃孵育30min，加220μl的缓冲液GB，60℃放置10min，再加220μl无水乙醇，将所有溶液加入吸附柱，依次用去蛋白液GD和漂洗液P各引物（见表1）、0.2mM各dNTPs、1×PCR缓冲液和2U的高保真TaqDNA聚合酶。2×TaqPCRMasterMix的使用完全按产品说明书进行。对于蛇粗毒样品，直接加入一定量的洗脱液作为模板，阳性对照为从蛇肌肉组织中提取的总DNA，不足部分以超纯水补足。扩增参数：94℃预变性3min，共循环32～35次，依次为94℃变性30～60s，55～60℃退火60

7、s，72℃延伸60s，最后在72℃延伸补齐5min。取PCR产物5μl用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR产物纯化、克隆和测序委托广州拓谱基因技术有限公司完成。表1线粒体基因扩增引物（略）2.3洗脱方式和模板用量对扩增效果的影响2.3.1洗脱方式的选择如图2所示，泳道1～3所用模板来自江西产舟山眼镜蛇肉（模板用量依次为150，60ng和30ng），泳道4、5所用模板来自蛇粗毒（模板用量为35μl，洗脱液类型分别为超纯水和TE）。所有样品均扩增出约0.45kb的目的条带，随着模板用量的减少，扩增产物的亮度不断减弱，不考虑蛇毒来源的基因组DNA

8、模板中可能存在的对PCR反应起抑制作用的成分，可粗略估算出从蛇粗毒中提取的基因组DNA浓度约为1ng/μl。泳道4比泳道5略暗，这说明洗脱液类型对扩增