DNA多态性分型技术2013.ppt

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1、第三节DNA多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院汪川什么是DNA多态性?多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性（geneticpolymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。DNA多态性对微生物有哪些实际意义？将导致——不同的细菌亚型——耐药菌株出现——毒力变异株出现——抗原漂移与抗原变异。。。。。。在疾病预防控制中的应用同源性追踪细菌分型传染控制DNA多态性分析常用的方法

2、限制性片段长度多态性分析随机扩增多态性DNA分析技术细菌基因组重复序列PCR技术扩增片段长度多态性分析技术（自学要考）脉冲场凝胶电泳。。。。。。一、限制性片段长度多态性分析restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP——以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的DNA作探针，将与被标记的

3、DNA相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。基本原理因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态性。基本原理基本方法提取基因组DNA制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳DNA变性、转膜、固定核酸杂交显影、显色、分析限制性内切酶(restrictionendonuclease，RE）一类能识别环状或线性双链DNA特定核苷酸序列的DNA水解酶，在合适反应条件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。内切酶的命名规则前三个字母代表其来源的细菌种名，用斜体字母，第四

4、个字母代表菌株名称，如果同一株菌有不同限制性内切酶系统，则不同的内切酶系用罗马数字区分。例：EcoRI代表该酶来源于E.coli的R菌株。琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪转移电泳槽核酸分子杂交的概念及原理核酸杂交:两个不同来源的、含有互补核苷酸顺序的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程。核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃~30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。核酸分子杂交技术原理根据探针上的标记，可用放射自显影或加入酶底物显色的方式观察结果。优点

5、1．可靠性较高2．来源于自然变异3．标记覆盖面广优缺点缺点：①检测步骤多，周期长；②对DNA需求量大，一般需要5~l0μg，纯度要求较高；③技术复杂，操作繁琐，工作量大；④具有放射性的危害；⑤检测成本高。讨论：RFLP与脉冲场凝胶电泳都是根据基因组上的限制性内切酶位点的多态性来对生物进行基因分型的，那么它们两者的异同点有哪些呢？基于上述RFLP的缺点，一种更好的分析技术——聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）应运而生。结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同

6、基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？基本原理根据名称：PCR-RFLP猜想本方法的原理？1.提取DNA2.设计特异引物进行目的基因PCR反应3.将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切4.将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离5.对显示出来的带谱进行分析。基本程序根据基本原理思考基本程序？优缺点优点：①敏感性高。②操作简便省时。缺点：①影响因素较多。②不能完全区分基因非常相似，甚至只有一个核苷酸差异的生物类型。RFLP与PCR-RFLP

7、的应用结核分枝杆菌IS6110-RFLP分析厌氧菌16SrRNA基因PCR-RFLP分析其他二、随机扩增多态性DNA分析技术randomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD以PCR技术为背景，以人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，经电泳分离后产生DNA指纹图谱。模板DNA经92～94℃变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3’端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。基本原

8、理RAPD