肠炎沙门菌随机扩增多态性dna分子分型论文

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1、肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型论文【关键词】肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型摘要：目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA，建立和优化随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增，筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用，每一菌株均可扩增出4～10条DNA片段，大多数片段在100～2000bp之间，共扩增出42条RAPD

2、条带，其中共有条带7条，多态性条带35条.freeloleculartypingSalmonellaenteritidisisolatesAbstract：ObjectiveMoleculartyping12strainsoftheSalmonellaenteritidisisolatedfromdifferentorigins.MethodsThegenomicDNAofdifferentSalmonellaenteritisstrainsamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)systemi

3、zed.22randomprimersonellaenteritisisolatedfromdifferentsources,andtheclearandconstantfingerprintsersnamedOPG-03,OPG-06,OPG-07andOPG-13plified4to10DNAfragmentsof100bp～2000bp.42RAPDbandsplified,833%ofthembeingpolymorphic.Theparativeresearchoftheclusteranalysisb

4、asedontheRAPDbandsspectrashoilaritycoefficientbet426%to100%,and12Salmonellaenteritisstrainsinthisexperimentcouldbeclassifiedto5groupsaccordingtotheirgeicrelationship.ConclusionUsingRAPDtosubtypeandcharacterSalmonellaenteritisatmolecularlevelismorerapidandsens

5、itivethanothertypingmethods,onellaenteritis;RAPD;type菌株分型对肠炎沙门菌的流行病学调查，以及研究其感染和传播机制具有重要意义。随机扩增多态DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD）具有操作简便、快速、敏感及不需先了解目的基因的核酸序列等优点，目前广泛应用于微生物的分子分型和鉴定、物种亲缘关系的确定及分子流行病学等领域的研究［1-3］。本研究应用RAPD技术对12株不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型，分析指纹图谱对其鉴别的价值并

6、确定不同菌株间亲缘关系，为肠炎沙门菌食源性疾病预防控制和鉴别诊断提供新方法。结果报告如下。1材料与方法11材料(1)菌株与来源:12株肠炎沙门菌分别来自病人分离株4株（菌株号为SEarker，dNTPs(大连宝生物工程有限公司)；溶菌酶,蛋白酶K，RNA酶,Sarkosyl(上海申能博彩生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。(3)随机引物:22条随机引物（编号为OPG-01～OPG-22）由上海申能博彩生物工程公司合成,.freell乳糖发酵(LB)培养基，37℃震荡培养18h，4℃冷却；6000r/min离心

7、15min，去上清，用预冷三羟甲基氨甲烷(TE)缓冲液洗涤和重悬菌体至3ml；加04ml溶菌酶（10g/L），37℃温浴10min；加04ml30%Sarkosyl溶液在70℃和37℃分别作用20和60min；加蛋白酶K，56℃作用2h；经苯酚多次抽提后加RNA酶37℃作用6h；苯酚抽提直至水相澄清；用无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤1次，自然干燥后溶解于1mlTE缓冲液。取10μlDNA样品用1%的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的完整性；取50μlDNA稀释到500μl，测定吸光度A260nm和A280nm检验纯度并计

8、算DNA浓度。122PCR扩增在总体积为25μl的反应体系中包含基因组DNA50ng作为模板，25μl10×PCR反应缓冲液，25mmol/LMg2+，Taq酶15U，200μmol/LdNTPs，25pmol随机引物，双蒸水空白做阴性对照；循环参数为：93℃2min，36℃1min，72℃2min1次循环；93℃1min，36℃1min，72℃2min，40次循环；93