沉香随机扩增多态性dna反应体系的建立

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1、沉香随机扩增多态性DNA反应体系的建立：邵敏周鹤峰唐历波刘银花李官成【摘要】　　目的对影响沉香随机扩增多态性DNA（RAPD）反应的各因素进行优化，建立适用于沉香RAPD的最佳反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，变化单一因素的方法对模板DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg2+浓度、退火温度对RAPD影响进行分析。结果建立了适合沉香RAPD分析的最佳反应体系：在20μl反应体系中，模板DNA用量20ng、Taq酶1.0U、dNTPs浓度为0.3～0.4mmol·L-1、随机引物浓度为0.6μmol·L-1、Mg2+浓度1.5～2

2、.0mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45个循环，72℃，8min。结论该反应体系具有良好的稳定性和重复性。【关键词】沉香；RAPD；基因组DNA；反应体系　　Abstract：ObjectiveToestablishtheoptimumRAPDreactionsystemofAquilariaagallochaRoxb.MethodsThegenomicDNAAquilariaagallochaRoxb.bymodifiedCTABmethod,andthedifferentTemp

3、lateDNA,Taq,dNTPs,Primer,Mg2+，theannealingtemperatureizedreactionsystemandprogramofRAPDforAquilariaagallochaRoxb.edinavolumeof20μl，erase,0.3～0.4mmol·L-1dNTPs,0.6μmol·L-1randomPrimer,1.5～2.0mmol·L-1Mg2+.Afterpre-denaturingat94℃for10min,undertheconditionofdenaturingat94℃for1min,annea

4、lingat36℃for1min,extensionat72℃for2min,amplifyingfor45cycles,finallyextensionat72℃for8min.ConclusionThereactionsystemisreproducibleandhighlystable.　　KeyicDNA;Reactionsystem　　沉香为瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有树脂的木材［1］，是一种热带亚热带常绿乔木。白木香是我国生产沉香药材唯一的植物资源，主要分布于广东省东南部、西南部、中部以南地区和海南

5、，属国家二级保护野生植物。沉香是临床常用的理气药，具行气止痛、温中止嗳、纳气平喘功效，用于治疗胸腹胀痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等症。据统计，建国至今有一千六百多个药方使用沉香；另外，沉香树是很好的园林绿化树种，又是珍贵的天然香料。长期以来由于森林资源、生态环境遭受灾害和人为破坏，天然沉香资源日趋枯竭。在现有的文献资料中，对白木香的研究主要集中在组织培养和化学成分等方面，遗传学方面的研究尚未见报道。　　随机扩增多态性DNA技术(randomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)是1990年由gCl2、随机引物、琼脂糖、CTAB、ED

6、TA、巯基乙醇购于上海生工生物技术有限公司；DNAMarker由大连宝生物公司提供。Hema-8000型PCR仪（珠海黑马仪器厂）、岛津UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；DYC型电泳仪（北京六一仪器厂）；5810R型冷冻高速离心机（eppendorf）。　　1.3DNA提取与检测采用改良的CTAB法提取基因组DNA［3］。紫外分光光度计检测DNA样品在230，260，280nm处吸光度；0.8%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片段大小和完整性，观察并拍照。　　1.4PCR扩增和RAPD反应体系的优化参考陈大霞等［3］的方法，扩增反应在Hema-8000型

7、PCR仪上进行。在RAPD分析之前，为了确定沉香基因组DNA最佳扩增条件，分别研究了模板DNA浓度、Taq酶用量、dNTPs、引物浓度、Mg2+浓度、退火温度对RAPD反应的影响，采用保持与其他因素一致的条件下，变化单一因素从而筛选最佳浓度，找出适合沉香RAPD反应的最佳反应条件。PCR扩增基本体系为：在20μl反应体系中，含模板DNA15ng、Taq酶1.0U、dNTPs0.3mmol·L-1、随机引物0.2μmol·L-1、Mg2+1.5mmol·L-1。PCR反应条件：94℃，10min；94℃，1min；36℃，1min；72℃，2min；45个循环

8、，72℃，8min。产物进行琼脂糖凝胶电泳。　　1.