白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化

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1、白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化陈要臻郭丁丁马逾英，陈雯，王晓东，唐琳【摘要】目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12份白芷为试材,对AFLP分析过程中包括提取DNA的方法、DNA的提取质量和浓度、MseⅠ/EcoRⅠ酶切反应时间等进行了研究，从64对引物中筛选适合白芷的引物。结果改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好，建立了一种适于白芷AFLP银染技术的优化体系：模板DNA的用量为400ng,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ反应时间为4h，筛选出了7对适

2、合白芷的引物。以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论建立了适用于白芷的AFLP反应体系，并筛选出了适合白芷的引物，为今后利用AFLP标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序。【关键词】扩增片段长度多态性反应体系;白芷　　Abstract：ObjectiveToestablishanoptimizedAFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)analysissystemofAngelicadahuruica.

3、MethodsTheoptimizedAFLPanalysissystemdifferenthabitatsafteraparativestudyoftheessentialfactorsethod.ResultsTheimprovedCTABconventionalmethodethod.TheresultsoftheanalysissystemshoplateDNAeofdigestsystemplificationshouldbedilutedto10times;4)sevenpairsofprimer(E

4、+AGC/M+CAA,E+ACT/M+CAC,E+AGC/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC)64pairsbyscreeningrepeatedly.AndE+AGC/M+CAAcouldamplifymoreuniformandhighsharpbands.ConclusionOurstudyshoolecularmap,identificationandclassification.Theseresultsprovidefundamen

5、talsforfurthermolecularstudiesofAngelicadahuruicausingAFLPmarker.　　Key;Angelicadahuruica　　扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）技术作为一项分子标记技术，是1992年由荷兰Keygene公司科学家ZabeauMare和Vospieter发明并发展起来的一种选择扩增限制性酶切片段的方法〔1〕。AFLP是基于RFLP(RestrictionFragmentLengt

6、hPolymorphism)和PCR(PolymeraseChainReaction)相结合的DNA分析技术。这种方法是一种选择性扩增限制性片段的方法,它结合了RFLP和RAPD的优点,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。现已被广泛应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多领域〔2〕。　　白芷Angelicadahurica为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。目前对白芷的研究主要集中在白芷的品质、化学成分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘关

7、系等方面的研究也有一些报道〔3，4〕，但是运用AFLP技术对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在建立一套适合于白芷的AFLP实验体系，并筛选出多态性强的引物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘关系AFLP实验奠定基础。　　1材料与仪器　　1.1材料白芷，2007-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。材料原产地见表1。样品经成都中医药大学生药教研室马逾英教授鉴定。取新鲜叶片，用硅胶迅速干燥后带回实验室，储于-70℃冰箱保存。　　表1供试材料及来源（略）　　1.2试剂EcoRⅠ，MseⅠ，T4DNAl

8、igase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。MseI／EcoRI接头、MseI／EcoRI核心引物及MseI／EcoRI选择性扩增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装。其他试剂均为国产分析纯。　　1.3仪器Bio-Rad(MC013208)PCR扩增仪，G