家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化

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1、家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化：刘红美,方小波,郑勤妮,胡仕明,吴建伟【摘要】　　目的：建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性（SRAP-PCR）扩增体系。方法:以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及TaqDNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化。结果:优化后的反应体系总体积为30μl,含50ng模板DNA、1.5mmol/LMg2+、0.20mmol/LdNTPs、0.15μmol/L引物和0.50UTaqDNA聚合酶。结论:家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行家

2、蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础。【关键词】蝇科;随机扩增多态DNA技术；遗传标记　　［Abstract］Objective:ToestablishandoptimizeSRAP-PCRreactionsystemofhousefly.Methods:EffectsofconcentrationsoftemplateDNA,Mg2+,dNTPs,primersandamountofTaqDNApolymeraseonSRAPmolecularmarkeramplificationsystemofMuscadomesticaLonofactorialexperiment,andthe

3、amplificationsystemized.Results:TotalvolumeoftheoptimalsystemplateDNA,1.5mmol/LofMg2+,0.20mmol/LofdNTPs,0.15μmol/Lofprimersand0.50UofTaqDNApolymerase.Conclusion:ThissystemprovidesausefultoolforanalysisofgeicdiversityandgenelocationofMuscadomesticaL.　　［KeyamplifiedpolymorphicDNAtechnique;geicmark

4、ers家蝇(MuscadomesticaL)是重要的医学媒介昆虫,能传播痢疾、伤寒、霍乱、脊髓灰质炎等多种疾病。近年来,随着家蝇体内抗菌肽的发现,家蝇在工业原料、医药保健和自然界物质能量循环等方面具有重要的应用价值。由于对家蝇的偏见,国内外从分子水平研究家蝇的报道还比较少,并且都只限于RAPD技术的利用[1]。相关序列扩增多态性(Sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP)是一种基于PCR原理的新型DNA分子标记技术,其技术的核心是PCR扩增,影响PCR扩增的因素都将影响到SRAP的成败。因此,对Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物

5、这5个因子进行优化,建立适合家蝇DNA的SRAP-PCR扩增体系,为SRAP系统在家蝇乃至昆虫中的研究鉴定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1供试材料　　驯化家蝇由贵阳医学院寄生虫学教研室2000年建立种群,并在实验室进行多代种群繁殖。幼虫以麦麸、蛆浆、面粉和水混合物为饲料,饲养温度（25℃±1）℃,相对湿度为50%～60%,光照12h。实验时选用肥大的3龄幼虫作为材料。　　1.1.2仪器、试剂　　实验用PCR扩增仪为Eppendorf5331梯度PCR仪;10×PCRbuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、琼脂糖和DL2000(Marker)等均购自大

6、连Takara(宝生物)工程有限公司。SRAP引物由上海鼎安生物科技有限公司合成,引物名称及序列见表1。表1SRAP引物及序列（略）　　1.2方法　　1.2.1家蝇基因组DNA的提取　　采用徐书华等[2]人的方法，提取家蝇3龄幼虫基因组DNA,DNA经紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测和定量,将纯度好、杂质少的样品于-20℃保存用于PCR扩增。　　1.2.2PCR体系、程序及检测　　参照Li等[3]的扩增反应体系。标准PCR反应体系中模板DNA100ng,dNTPs0.2mmol/L,上下游引物0.2μmol/L,1.5mmol/LMgCl2,1UTaq酶,总体积为30μl。扩

7、增程序采用复性变温法：开始95℃变性2min,反应前5个循环在94℃1min,35℃1min,72℃2min条件下运行；之后35个循环为94℃1min,50℃1min,72℃2min；最后72℃延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳检测,电极缓冲液采用0.5×TBE,稳电压80V,30min。溴化乙锭染色,凝胶成像系统观察并拍照。　　1.2.3SRAP引物筛选　　用1.2.2项下获得的SRAP-PCR扩增体系和扩增程序进行表1中正向引物间的组合、反向