正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究

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1、正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究作者：李海渤，王羽梅，何金明【摘要】目的建立茴香的随机扩增多态DNA最佳反应体系。方法正交设计及方差分析应用于建立RAPD反应体系的研究。结果茴香的RAPD最佳反应体系为2μl的反应体系中，含10×Buffer.μl，mμl，U/μlTaq酶μl，μmol/L随机引物μl，ng/μl模板DNA30ng，ddH2O13.μl。结论正交设计及方差分析适用于茴香RAPD反应体系的建立。【关键词】茴香；正交设计；随机扩增多态DNA；反应体系；方差分析Abstract：Ob

2、jectiveToestablishoptimalRAPDreactionsystemoforthogonaldesignandvarianceanalysiswereusedtooptimizetheRAPDoptimalFennelRAPDsystemwascomposedof.μl10×PCRBuffer,μldNTPs(mmol/L),μlTaqE(U/μl),μlPrimer(μmol/L),μlDNA(ng/μl),13.μlddH2Owithtotalμlreactionorthogonaldes

3、ignandvarianceanalysiscanbeusedtooptimizetheRAPDsystem.Keywords：Fennel;Orthogonaldesign;RAPD;Reactionsystem;Varianceanalysis　　茴香FoeniculumvulgareMil1.为伞形科茴香属多年生宿根草本植物，原产地中海沿岸及西亚，在我国北方各地被广泛栽培。　　茴香的茎、叶、种子都含有挥发油，其主要成分为茴香醚及茴香酮，具有特殊的香味。我国北方主要把茴香作调味品或馅食。其果实可作香料及药用

4、，有温肝肾、暖胃气、散寒结的作用［1］。　　随机扩增多态DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)标记是由Williams等和Welsh等在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记，广泛应用于遗传多样性分析、物种进化、品种鉴定、分类等研究领域。为了更好地利用RAPD技术对茴香进行聚类分析，确定品种间亲缘关系，进而为茴香育种提供理论指导，本研究以内蒙古茴香DNA为材料，采用正交设计构建扩增方案，并对实验结果进行方差分析，对各因素水平间进行了SSR法多重比较，最终建立了适合于茴香

5、的RAPD最佳反应体系，以期为进一步的RAPD研究打下坚实的基础。1材料与方法DNA的提取以SDS法提取内蒙古茴香总DNA，以％(W／V)琼脂糖凝胶电泳检测所得DNA质量，并用UV3000型紫外分光光度计检测DNA浓度，ddH2O稀释至ng/μl。正交设计方法选用L25正交表。共设计25个处理，反应总体积为2μl，每个反应体系均含10×PCRBuffer2.μl，其余组分［TaqDNA聚合酶、dNTPs；引物；DNA］按表1稀释并添加，再用ddH2O将体系补至μl。表1RAPD反应体系的正交设计及扩增结果PCR

6、扩增与产物检测在FTH-04AB-102型PCR仪上进行扩增，热循环参数为9℃预变性min，9℃变性1min，45℃退火1min，7℃延伸min，35个循环，最后7℃延伸10min，℃保存。　　扩增产物在％(W／V)琼脂糖凝胶中电泳，以λDNA为Marker，经EB染色。在hnageMasterVDS凝胶成像系统上成像检测，照相并存盘。数据分析统计每个处理扩增后DNA片段数目，并参照Marker电泳片段的亮度对处理所得片段亮度进行打分，打分标准为：片段亮度大于等于212bp片段，分值为5分；片段亮度介于146～

7、530bp片段之间，分值为4分；片段亮度介于027～10bp片段之间，分值为3分；片段亮度介于184～17bp片段之间，分值为2分；片段亮度低于17bp片段，分值为1分。平均片段亮度＝某处理片段亮度得分总和/某处理片段总数。　　对所得片段数目及亮度两个结果分别进行方差分析及SSR法各因素水平间多重比较，获得较好的反应体系。最佳反应体系的验证为验证最佳反应体系的稳定性，采用多个引物对多个茴香材料进行RAPD扩增，观察其重复性及稳定性。　2结果.1正交设计的处理结果及分析选用引物P41按表1设计对内蒙古茴香进行RA

8、PD扩增。分别对表1扩增片段数量及扩增片段亮度进行方差分析。结果见表～3。.扩增片段数量从表2可知，MSe1/MSe2＝≤＝，说明实验因素之间差异不显著，即实验因素之间无交互作用。故将模型误差MSe1与试验误差MSe2合并，得MSe＝/＝，进行方差分析。F检验结果表明，dNTPs、随机引物因素对扩增片段数量有极显著影响，而Taq酶、模板DNA因素对扩增片段数量影响不显著，区组间差异不显