青天葵总dna的提取与随机扩增多态性dna反应条件的建立

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1、青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立【摘要】　　目的建立并优化青天葵样品总DNA提取方法及随机扩增多态性DNA（RAPD）反应。方法采用改进的高盐低pH法提取青天葵鲜叶和药材样品，通过正交设计和均匀设计，改变反应体系和扩增程序优化随机扩增多态性DNA。结果使用高盐低pH值法可较好地提取新鲜叶片的DNA，药材叶片含杂质较多，但都能用于RAPD。反应体系为：缓冲液2.0μ1，0.5μldNTP（各2.5mmol·L-1），0.8μlMg2+（25mmol·L-1），0.5μl引物（20pmol·μl-1）,0.2μlTaq酶（5U·μ1-1），1μlDN

2、A（50ng），1μlBSA（20mg·ml-1），加双倍蒸馏水至20μl。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸60s，40个循环；72℃延伸5min。结论建立并优化了的青天葵样品总DNA提取方法及RAPD反应体系。【关键词】青天葵DNA提取随机扩增多态性DNA正交设计均匀设计　　Abstract：ObjectiveToestablishandoptimizethemethodsoftotalDNAextractionandRAPDanalysisofNerviliafordii.MethodsLoediumethodicDN

3、AfromfreshandmedicinalmaterialleavesofNerviliafordii,andtherandomlyamplifiedpolymorphicDNAs(RAPD)techniqueizedthroughchangingPCRreactionsystem.ResultsLoediumedicinalmaterialleaves,butbothofthemcouldbesuitabletoRAPD.TheoptimalRAPDconditionsM)，0.8μlMg2+(25mM)，0.5μlPrimer(20pmol·μl-1),0.2μl

4、TaqDNApolymerase(5U·μl-1)，1μlDNA(50ng)，1μlBSA(20mg·ml-1)．RAPDprograminat94℃forpredenaturation，then40cyclesof30secat94℃fordenaturation,30secat40℃forannealing，1minat72℃forextension，finallyextensionat72℃for5min．ConclusionTheextractionmethodsfortotalDNAandRAPDanalysisofNerviliafordiihavebeen

5、established.　　Keydesign　　随机扩增多态性DNA(RandomamplifiedpolymorpHicDNA，RAPD)是由A3-18K离心机；GENEQUANTPRO紫外分析仪；VILBERBioprint1000凝胶成像系统；北京六一仪器厂电泳槽。　　2方法　　2.1DNA提取方法　　采用高盐低pH值法提取DNA［5，6］。称取1～2g青天葵新鲜叶片或0.2～0.3g青天葵干品药材叶片用石英砂研磨，加入5ml65℃缓冲液（100mmol·L-1NaAc，50mmol·L-1EDTA，500mmol·L-1NaCl，1.4%SDS）65℃水浴30

6、min，时时振摇，10000g离心10min。取上清加入2/3倍体积2.5mol·L-1pH4.8的醋酸钾溶液，4℃放置20min，10000g离心10min。吸上清液移入另一支离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)抽提反复颠倒混匀，于4℃10000g离心10min，如中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿-异戊醇(24：1)抽提1次。取上清液加入1倍体积异丙醇，混匀后放入-20℃冰箱20min。10000g离心15min。所得DNA沉淀用70％乙醇洗2次，空气中干燥。溶于200μl无菌水中，4℃保存。　　2.4电泳条件DNA样品与PCR样品于含Goldvie,50min

7、。凝胶成像系统拍照保存。　　3结果　　3.1DNA提取的优化本实验采用高盐低pH值法提取样品的DNA，因为实验材料有干品药材，王培训等［6］认为高盐低pH值法较CATB、苯酚法适合于干品药材。高盐低pH法的优越性还在于，不采用酚、氯仿等有毒试剂，不需CTAB、酶等价格较高的试剂，技术环节容易掌握［7］。本实验用高盐低pH法能较好地提取新鲜叶片，但用于提取干药材时得到的DNA颜色较深，电泳结果显示干叶片的DNA模板有降解，或看不到条带。于是采用药材提取前用30%乙醇处理浸泡7d［8］，或对药材用100mmol·L-1的Tris-HCl(PH