道地药材浙玄参的随机扩增多态性DNA研究

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1、道地药材浙玄参的随机扩增多态性DNA研究作者：朱振洪，万海同，余勤，刘文洪，韩进【摘要】目的探讨道地药材浙玄参与非道地药材之间遗传变异大小，并建立道地药材浙玄参的品质鉴定方法。方法运用随机扩增多态性DNA(RAPD)法对产于浙江、山东、湖北的玄参科植物玄参进行了分子标记研究。结果共筛选出9条有效引物，获得142条DNA带，通过聚类分析，构建DNA分子系统树图，确定不同居群间的亲缘关系。结论同种异地药材所形成的不同居群，具有不同的遗传多样性特征。其中浙玄参与山东、湖北玄参存在较大遗传差异，说明浙玄参作为道地药材，具有自身独特的遗传特征。【关键

2、词】道地药材;玄参;随机扩增多态性DNA;聚类分析　玄参别名元参、黑参、浙玄参，为玄参科植物玄参ScrophulariuningpoensisHemsl.的干燥根，具有滋阴降火、解毒之功效。主产于浙江，另外在山东、湖北、四川、陕西等也有栽培。其中以浙江产玄参为道地药材，为著名的“浙八味”之一。由于该药材品种多、产区广，单纯地依赖形态分类、组织学或化学指纹如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等难以区别[1]。现代分子生物学研究表明，中药材生物资源的多样性是由于其基因多态性导致的[2]。为从基因角度揭示“道地”7药材的生物学本质，本文采

3、用RAPD技术分别对来源于浙江、山东、湖北产地的玄参进行遗传多样性研究，旨在为道地药材浙玄参的药材鉴定、栽培繁育、质量评价提供依据。　　1材料与仪器　　1.1供试植物材料分别采于浙江临安、湖北恩施、山东青州等地。取新鲜健壮嫩叶置液氮罐中，带回实验室-70℃冰箱中保存。　　1.2DNA提取试剂提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，50mmol/LEDTA(pH8.0)，500mmol/LNaCl，10mmol/Lβ-巯基乙醇。20%SDS，5mol/LKAc，10mg/mlRNaseA，异丙醇，灭菌水等。　　1.3PC

4、R试剂10核苷酸随机引物由上海生工生物工程公司合成，共70条(序列编号分别为：S1～S40，S71～S90，S111～S120);DNA聚合酶、Buffer等为MBI公司产品。　　1.4仪器SIGMA3K-15高速冷冻离心机，PCR仪(Biometrapersonal，Germany)，琼脂糖电泳仪和凝胶成像系统为上海天能科技有限公司产品。　　2方法7　　2.1基因组DNA提取方法采用改良SDS法提取基因组[3]，具体操作如下：取1g叶片，剪碎后加入适量PVP，一起于液氮中研磨成粉。转移粉末到加有500μl提取缓冲液的离心管中，轻轻混匀，使

5、粉末充分散开。加入50μl20%SDS溶液，混匀后于65℃水浴中保温10～15min(间断晃动2～3次)。加入150μl5mol/LKAc，混匀，置冰上20～30min。4℃12000r/min离心15min。上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。4℃12000r/min离心15min，上清液转入另一离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，-20℃放置30min。4℃12000r/min离心15min，弃上清液，沉淀自然晾干后加入50μlTE缓冲液溶解，并加入10mg/mlRNA酶1μl，于37℃保温1h。电泳检测基因

6、组的完整性。　　2.2引物筛选及PCR方法[4]首先进行随机引物的筛选，10核苷酸随机引物购自上海生工(编号分别为：S1～S40，S71～S90，S111～S120)，PCR反应体为：10×PCRbuffer2.5μl，25mmol/LMgCl23μl，2.5mmol/L4dNTP1.5μl，引物(0.5μmol/L)1μl，模板DNA(100ng)1μl，Taq聚合酶(5U/μl)0.5μl，补加双蒸水至25μl。PCR仪的反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，36℃退火45s，72℃延伸1min，共44个循环，72℃保温7

7、min。PCR结束后用1.2%的Agrose进行电泳分析结果。　　2.3RAPD数据分析[5]按琼脂糖凝胶同一位置上DNA7带的有无进行统计,有带(包括弱带)记为“1”,无带记为“0”。利用NTSYS(2.10e)软件对RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各物种之间的遗传距离，并构建DNA分子系统树。　　3结果　　3.1改良SDS法提取植物基因组DNA植物基因组抽提方法常用的有CTAB法和SDS法，植物中的主要矛盾是粉碎破壁困难和糖类的影响，所以一般采用阳性表面活性剂的方法。最常用的就是CTAB和SDS。但CTAB的表面活性比SDS差，所以

8、本实验采用改良SDS法，其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用异丙醇沉淀。用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测，发现