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1、半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析论文.freelplasmresourcesofPinelliaternataonmolecularlevel.MethodsThegeicdiversityofP.ternata21differentpopulationsarkers.ResultsAtotalof162productsplifiedby2910-merarbitraryprimers,123(75.9%)productsorphic.TheresultsrevealedtheabundantgeicdiversityinP.ter
2、nata21differentpopulations.TheclusteranalysisusingUPGMAmethodshouchgeicdiversityonmolecularlevelamongthegermplasmresourcesofP.ternata.RAPDmarkerscouldbeeffectivetoolstoconstructDNAfingerprintingsofP.ternata.KeyamplifiedpolymorphismDNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少
3、、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参2、石斛3等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。1材料与方法1.1药材采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。1.2DNA的提取取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入60
4、0μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5mLSDS抽提液100mmoL/LTris-HCl(pH8.0)；100mmol/LEDTA(pH8.0)；0.5mol/LNaCl；1.5%(yCyclerTMPCR仪上进行。反应总体积25μL,内含1×PCRbuffer,1.5mmol/LMgCl2,1UTaq酶,0.25μmol/L引物；100ng模板DNA,dNTPs各0.2mmol/L。扩增前94℃预变性3min,每循环在94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72℃保温10min,
5、然后在4℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。1.4统计学方法RAPD扩增产物按条带有无分别赋值,有带记为1,无带记为0。利用软件POPGENE处理得到遗传相似系数(GeicSimilarities,GS)4。利用GS按不加权成对群算术平均法(unethodeticaverage,UPGMA)进行聚类。统计分析在NTSYSpc5软件系统下进行。表1供试的半夏来源（略）2结果与讨论2.1扩增片段多态性RAPD扩增结果表明：29个引物中有28个(96.6%)引物的扩增产物具多态性。图1为引物S2
6、0的扩增结果。29个引物共得到162条扩增DNA片段,平均每个引物可获得5.6个DNA片段,其中123条具有多态性,占75.9%。表明半夏种质资源多态性水平较高,充分体现了半夏不同居群间的遗传多样性。2.2遗传相似系数半夏21个不同居群的遗传相似系数值见表2。从中可见,半夏不同居群间的GS分布较广,范围为0.5926～0.8951,说明其遗传背景较复杂,表明其遗传多样性相对较丰富。PT0002居群的半夏与PT0009居群的半夏相似系数最大,高达0.8951,说明它们的亲缘关系最近。另外,PT0002居群的半夏与PT0054居群的半夏相似系数最
7、小,为0.5926,说明它们的亲缘关系较远。表221个半夏居群遗传相似系数值（略）2.3供试材料的聚类分析结果将21个居群材料RAPD的扩增结果,利用POPGENE软件得到的遗传相似性系数数据,再利用NYSYSpc软件进行各品种间UPGMA聚类分析,构建聚类分析图(见图2)。从聚类图可以看出,在遗传相似系数0.68处,所有材料可以划分成3组,即Ⅰ组：居群PT0001,PT0037,PT0014,PT0026,Ⅲ组：居群PT0030单独成组。其中,Ⅰ组和Ⅱ组又可分为亚组。材料PT0030为陕西省汉中居群,它与其它材料间的亲缘关系较远,故单独成组
8、且在较小的相似性系数处与其它材料聚在一起。可以认为在很大程度上是由于受汉中当地生态环境条件的影响较大,基因型改变较大,因而在聚类图上单独成组。图2还表明,不同产地的
