远志种质资源遗传多样性随机扩增多态性dna分析

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1、远志种质资源遗传多样性随机扩增多态性DNA分析【摘要】目的用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析远志PolygalatenuifoliagCl22.0μl,引物1.0μl,模板2ng,Taq酶0.3μl。扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行45循环：94℃变性15s，36℃复性1min，72℃延伸1.3min，循环结束后72℃延伸4min。结果10个引物共检测到154个位点，平均每个引物扩增9.24条带，其中148条带表现为多态性，占总带数的94.3％；距离系数为24时，11个样品明显聚为远志居群和卵叶远志居群两类。结论远志与卵叶远志具有丰富的

2、遗传多样性，遗传聚类与其地理分布有一定的相关性。.L.编辑。【关键词】远志；卵叶远志；遗传多样性；随机扩增多态性DNA　　Abstract:ObjectiveToanalyzegeicdiversityofPolygalatenuifoliayCyclerTMThermalCycler（德国）；ThermeElectronTM加样器。　　1.2试剂　　10mer随机引物（北京赛百盛基因技术有限公司），λ-EcoT14IdigestDNAMarker(TakaRa)，DNAMarker15000(TakaRa)，DNAMarker2000(TakaRa)，

3、Taq酶(TaKaRa)2500U，dNTPs(TaKaRa)2.5mmol/L，MaCl2(TaKaRa)25mmol/L，10×Buffer（Mg2＋free）(TaKaRa)，CTAB(Amresco)，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，琼脂糖（上海YITO生物仪器有限公司分发），其余为国产试剂。　　1.3材料　　分别从四川、甘肃、陕西、山西、河北等地采得远志P.tenuifoliag用硅胶干燥的远志叶片，置-70℃冰箱冷冻1h，取出后在研钵中快速磨成粉末，迅速将粉末转入1.5ml离心管中，加入700μlCTAB提取液，置65℃金属

4、浴中30min，其间不时摇动。②取出冷却至室温，加等体积氯仿/异戊醇（24∶1），混匀后于12000g/min离心10min。③取上清液，重复操作②。④取上清，加入2/3体积的异丙醇，于-20℃放置30min，于10000g/min离心10min，去上清。⑤用80％乙醇洗沉淀2次，风干沉淀。⑥将沉淀溶于100μlddH2O中，-20℃保存备用。　　采用凝胶自动成像系统照相，检测DNA的质量和含量，取2μl加样缓冲液（6×Buffer）与10μlDNA样品混合，在0.9％琼脂糖凝胶上以5V/cm电压条件下电泳，在紫外灯下观察电泳凝胶。用凝胶自动成像系统照相

5、，用TotalLab软件分析凝胶图像，定量。基因组DNA电泳图谱见图1。　　2.2RAPD扩增条件的建立　　分别对模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量等RAPD扩增条件进行优化。最终确定反应体系为：反应总体积25μl，内含10×PCRbuffer2.5μl，dNTPs2.0μl，MgCl22.0μl，引物1.0μl，模板2ng，Taq酶0.3μl。扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行45循环：94℃变性15s，36℃复性1min，72℃延伸1.3min，循环结束后72℃延伸4min，-4℃保存。扩增产物在1.4%琼脂糖

6、凝胶上电泳，电压5V/cm，电泳缓冲液为1×TAE。反应产物以DNAMarker2000为分子量标记，在凝胶成像系统上观察、照像、记录。　　2.3引物筛选　　利用建立的RAPD条件，对40条10bpRAPD随机引物进行筛选，选扩增条带清晰、多态性强的10条引物作为RAPD引物。筛选引物的碱基序列见表2。　　2.4数据处理　　每个样品电泳条带按有或无记录，电泳条带存在时赋值为1。否则赋值为0。利用SPSS10.0按Nai＆Li(1979)的方法计算材料间遗传相似系数(GS)。计算公式为：GS=2Nxy/(Nx+Ny)，其中Nxy为材料x和y共有的扩增片段数

7、目，Nx、Ny为材料x、y中出现的扩增片段总数目。根据遗传距离，按UPGMA法，选择类间平均连锁法（Bet.