金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态dna

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1、金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA作者：王燕燕徐红魏丹红王峥涛【摘要】目的对影响金钗石斛随机扩增多态DNA（RAPD）-PCR扩增效果的一些因素进行优化，为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化，建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系。结果金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为：10μlPCR反应体系中，5～20ng模板DNA，3.0mmol·L-1Mg2+，0.34mmol·L-1dNTPs，0.6UTaqDNA聚合酶，1.5μmol·L-1引物，较适宜的退火温度为36℃。结论所建立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位

2、点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等特点，可用于金钗石斛的遗传多样性研究。以该优化的RAPD条件进行重复性实验，其实验结果重复性良好。【关键词】金钗石斛；随机扩增多态DNA反应体系；优化　　Abstract：ObjectiveToestablishandoptimizeRAPDPCRsystemofD.nobileLindl.MethodsThereliableRAPD-PCRsystemforthegeicdiversitystudyofD.nobileLindl.establishedbysystematicallytestingandoptimizingtheimportantc

3、oncentrationsofthefactors.ResultsTheconditionsthatcontained5～20ngtemplateDNA,3.0mmol·L-1Mg2+,0.34mmol·L-1dNTPs,0.6UTaqDNApolymeraseand1.5μmol·L-1prime.ThesuitableannealingtemperatureintheRAPD-PCRreactionsystem,orphicmolecularmarkers,stablereactionsystem,andissuitableforstudyingthegeicdiversityofD.no

4、bileLindl..Theexperimentresultsarereproduciblebasedonthisconditions.　　Key;Optimization　　金钗石斛DendrobiumnobileLindl.又称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科(Orchidaceae)石斛属DendrobiumSAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技术是由g2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等影响RAPD反应的诸因素进行了构建和优化，建立多态性强、稳定性好的金钗石斛RAPD反应体系，为进一步研究金钗石斛的遗传多样性、开发利用这一珍稀药用

5、资源提供技术支持。　　1材料与仪器　　1.1材料金钗石斛，新鲜材料于2005年采自云南文山县，现保存于上海中医药大学中药研究所，材料经上海中医药大学中药研究所徐红博士鉴定原植物学名。　　1.2仪器PTC-200型PCR仪（MJResearch公司）；凝胶成像系统（美国PharmaciaBiotech）；电泳仪（Bio-Rad）；核酸蛋白分析仪（美国Beckman）；离心仪（美国Beckman）。　　1.3试剂CTAB、β-巯基乙醇、TrisBalancedPhonel、Tris、EDTA、琼脂糖均为分析纯；10×PCRbuffer,TaqDNApolymerase(Taq酶),MgCl2,dN

6、TPs试剂购于上海生工公司；RAPD引物采用的为适于进行金钗石斛RAPD扩增的随机引物，由上海生工公司提供。　　2方法　　2.1总DNA的提取采用改良的CTAB法。取新鲜叶片约1.2g，用双蒸水洗净，加液氮手工研磨成细粉，迅速转移至4个10ml离心管中，加入已65℃预热的2%CTAB提取液5ml，混匀，65℃保温2～4h，期间多次轻轻颠倒混匀，使DNA提取充分；待提取液冷却至室温，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提10min，12000r·min-1，离心10min，吸取上清液，再用1/3体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提10min，12000r·min-1，离心

7、10min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)萃取液，上下多次颠倒，萃取充分直至两相间无白色中间层，12000r·min-1，离心10min，吸取上清液，加1/2体积的异丙醇，1/10体积的3mol·L-1NaAc，混匀，-20℃放置0.5～1h，12000r·min-1，4℃，离心10min，弃液，70%乙醇洗涤沉淀物2次(4℃，12000r·min-1，离心5min)，挥干至无醇味