金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNAPCR反应体系的建立与优化

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1、金钗石斛遗传多样性研究的随机扩增多态DNA-PCR反应体系的建立与优化作者：王燕燕徐红魏丹红王峥涛【摘要】目的对影响金钗石斛随机扩增多态DNA（RAPD）-PCR扩增效果的一些因素进行优化，为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法对金钗石斛RAPD分析中一些重要影响因素进行比较系统的构建和优化，建立金钗石斛RAPD稳定可靠的反应体系。结果金钗石斛较适宜的RAPD-PCR反应条件为：10μlPCR反应体系中，5～20ng模板DNA，3.0mmol·L-1Mg2+，0.34mmol·L-1dNTPs，0.6UTaqDNA聚合酶，1.5μmol·L-1引物，较适宜的退火温度为36℃。结论所建

2、立的金钗石斛RAPD反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强等特点，可用于金钗石斛的遗传多样性研究。以该优化的RAPD条件进行重复性实验，其实验结果重复性良好。【关键词】金钗石斛；随机扩增多态DNA反应体系；优化　　Abstract：ObjectiveToestablishandoptimizeRAPDPCRsystemofD.nobileLindl.MethodsThereliableRAPD-PCRsystemforthegeneticdiversitystudyofD.nobileLindl.establishedbysystematicallytestin

3、gandoptimizingtheimportantconcentrationsofthefactors.ResultsTheconditionsthatwere15suitableforRAPD-PCRofD.nobileLindl.wereasfollows:10μlPCRreactionsystemcontained5～20ngtemplateDNA,3.0mmol·L-1Mg2+,0.34mmol·L-1dNTPs,0.6UTaqDNApolymeraseand1.5μmol·L-1prime.ThesuitableannealingtemperatureintheRAPD-

4、PCRreactionsystemwas36℃.ConclusionTheRAPD-PCRsystem,whichwasestablishedinthispaperforstudyingD.nobileLindl.,canprovideclear,reliable,abundantpolymorphicmolecularmarkers,stablereactionsystem,andissuitableforstudyingthegeneticdiversityofD.nobileLindl..Theexperimentresultsarereproduciblebasedonthi

5、sconditions.　　Keywords：D.nobileLindl.;RAPDreactionsystem;Optimization　　金钗石斛DendrobiumnobileLindl.又称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科(Orchidaceae)石斛属DendrobiumSw.植物，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效，是中药石斛的主要来源之一。《本草纲目》中记载：金钗石斛可“强阴益精，厚肠胃，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年”15等，是药用范围较广的名贵中药；又由于其花型奇特、花色艳丽，而具有较高的观赏价值［1］。近年来，我国学者对金钗石斛的生物学特性、药用

6、价值、人工栽培、化学成分、药理、毒理等方面进行了较为广泛的研究［1～3］，而有关遗传多样性方面研究甚少。　　随机扩增多态DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技术是由Williams等于1990年创立的一种DNA分子标记方法，它可直接反映染色体组DNA多态性，能从遗传本质上揭示品种间多态性及亲缘关系，不受环境限制，具有操作简单快捷、成本低、通用性好、灵敏度高且不需预先了解基因组的相关分子生物学信息等优点［4,5］，被广泛应用于种质资源分析、生物种群划分、遗传相关分析、遗传图谱构建、基因定位等方面［6］。　　本实验就模板浓度、Mg2+浓度、dNT

7、P浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等影响RAPD反应的诸因素进行了构建和优化，建立多态性强、稳定性好的金钗石斛RAPD反应体系，为进一步研究金钗石斛的遗传多样性、开发利用这一珍稀药用资源提供技术支持。　　1材料与仪器　　1.1材料金钗石斛，新鲜材料于2005年采自云南文山县，现保存于上海中医药大学中药研究所，材料经上海中医药大学中药研究所徐红博士鉴定原植物学名。15　　1.2仪器PTC-200型PCR仪（MJResearch公司）；凝胶成像系统（美国