DNA多态性分型技术四川大学讲义

《DNA多态性分型技术四川大学讲义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三节DNA多态性分型技术四川大学华西公共卫生学院张薇薇Email:solozww@163.com.QQ:363002530分型技术有那些?-血清学分型-生物化学分型-噬菌体分型………….传统的分型技术分子生物学分型技术?-PFGE-限制性酶切图谱分析-PCR技术-质粒图谱脉冲场凝胶电泳pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE原理琼脂糖凝胶依靠不同的分子筛效应对大小不同的DNA分子进行分离。超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小

2、无关，而主要决定于电场强度。但PEGE解决了这一问题原理PFGE利用定时改变电场方向的交流电源，每次电流方向改变持续ls到5min左右，然后改变电流方向反复循环，故称为脉冲式交变电场。随着电场方向的交替变化，DNA分子呈“Z”形向前运动。每改变一次电场方向，大的伸展的DNA分子就必须重新定向，在新的方向上通过凝胶。重新定向所需的时间与DNA分子的长度成正比。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图（1）细菌培养（2）制备胶块（3）菌体裂解（4）胶块洗涤（5）酶切（6）电泳（7）结果处理PFGE图谱获得过程最大限度的保证全基因组的完整性脉冲式交

3、变电场PFGE优势重复性好,分辨力强,被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”PFGE的局限性无法分辨点突变、微小突变内切酶选择很关键，否则无法找到图谱费时，仪器要求高，技术要求高，成本较高PFGE的优势和局限性任何一种技术都不是完美的！还有没有其他技术作为补充？DNA多态性?分型技术?Yes!自然界的生物的个体差异我是独一无二滴!不同or差异?多态性（polymorphism）定义:是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性或基因多态性(geneticpolymorphism).从本

4、质上来讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。DNA多态性在微生物中的实际意义？将导致——不同的细菌亚型——耐药菌株出现——毒力变异株出现——抗原漂移与抗原变异。。。。。。在疾病预防控制中的应用同源性追踪细菌分型传染控制DNA多态性分析常用的方法限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)随机扩增多态性DNA分析技术(RAPD)细菌基因组重复序列PCR技术(rep-PCR)脉冲场凝胶电泳(PFGE)。。。。。。DNA多态性分析常用的方法限制性片

5、段长度多态性分析技术(RFLP)扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)随机扩增多态性DNA分析技术(RAPD)细菌基因组重复序列PCR技术(rep-PCR)脉冲场凝胶电泳(PFGE)。。。。。。——1974年首创，以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记，是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用一、限制性片段长度多态性分析Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异

6、性来检测生物体多态性基本原理每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的DNA作探针，将与被标记的DNA相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。核酸分子杂交技术原理核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃~30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。RFLP操作流程图基本方法转移电泳槽聚合酶链反应-限制性片段长

7、度多态性分析技术PCR-RFLP基本原理结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。2021/8/5四川大学华西公卫裴晓方26KaryMullis1993年因此荣获诺贝尔化学奖聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术。由变性、退火、延伸三个基本步骤构成PCR反应五要素的优化1、多聚核苷酸引物2、TaqDNA聚合酶3、dNTP（三磷酸脱氧

8、核苷酸）4、模板核酸5、缓冲液基本程序1.提取DNA2.设计特异引物进行目的基因PCR反应3.将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切4.将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离5.对显示出