DNA多态性及其分析技术.ppt

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1、第一节多态性概述一.定义不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物的多态性（polymorphism）。生物群体中个体间的变异有的是由环境因素，如营养、气候等造成的；有的则是由遗传因素造成的。由遗传因素造成的变异形成一系列的多态性，称为遗传多态性（geneticpolymorphism）。二.标准发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。在某些时候，一个

2、基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性（dimorphism）。三.分类遗传多态性主要可分为遗传表型的多态性和DNA的多态性两大类。由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型。检测遗传表型多态性有其局限性：①遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分变异。后者只占人基因组总DNA的10%（＜10%）。基因及基因相关序列占总DNA的25%。②DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变。这时检测表型就不能发现编码基因中存在的变异。③基因的表达会

3、有变异，基因型完全相同的生物体在不同的生长条件下可能有不同的表型，靠检测表型多态性来推断基因有时会出现错误结论。分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的多态性。人类基因组序列概况人类基因组30亿碱基对非基因序列70%～80%基因及相关序列20%～30%编码序列＜10%中度或高度重复序列20%～30%单一数或低拷贝序列70%～80%簇状重复60%第二节DNA多态性的分类DNA是遗传信息的物质基础，因而是反映个体间差异的最本质东西。DNA序列组成的个体特异性主要表现为下列类型的DNA多态性。一.基

4、因多态性由于控制性状的基因碱基组成上的不同造成的多态性。采用等位基因特异性探针（ASO或SSO探针）或限制酶切消化进行分析。如人类白细胞抗原（HLA）系统，编码HLA-DR抗原的位点有超过200个等位基因。二.重复序列多态性串联重复序列多态性（variablenumbersoftandomrepeats,VNTR）：①相同的核心序列，不同的个体重复的次数不同。②不同的重复序列，其核心序列的组成会不同。③在核心序列之间，不同的个体间会存在有无插入小段DNA或插入的片段长短不同的差异。因此，两个无关

5、个体的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度，这是DNA指纹形成的基础。中度重复的散在重复序列多态性。遍布哺乳动物基因组中三.性染色体多态性X染色体的重复序列多态性Y染色体的特异性片段多态性。四.线粒体的DNA多态性人线粒体DNA的D环两个无关个体间，完全相同的可能性只有0.27%。第三节DNA多态性分析技术一.RFLP分析技术基本原理限制性酶切片段长度多态性技术（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）：用某种特定的限制性内切酶消化不同的DNA片段

6、，由于DNA的碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段。这样采用合适的限制性内切酶消化待分析的DNA片段，就能根据切出来的片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交，显出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。这一技术的基础是通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同。抽提DNA（从血或组织）培养细菌人工合成探针限制性内切酶消化琼脂糖凝胶Southern转移、固定质粒纯化纯化探针标记探针（同位素或非同位素）预

7、杂交杂交洗膜反射自显影或显色后分析结果RFLP技术图解RFLP技术的基本步骤一.靶DNA的准备先将人基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离，使其按片段的长短排列，将DNA片段变性后转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上（称为印迹转移，即Southernblot），并固定在这些载体上面。二.核酸探针的标记将准备作为探针的DNA片段纯化，用同位素（如32P）或非同位素标记，经纯化后使用。三.杂交显示将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼

8、龙膜上的单链DNA杂交，洗膜以后进行放射自显影或加入酶的反应底物显色，再对显示出来的谱带进行分析。影响RFLP的几个因素一.限制性内切酶影响RFLP图谱的重要因素。市售常见的有100多种。星号*活性即非特异性酶解活性。反应液中甘油、乙醇浓度及被酶解DNA的质量和浓度。二.核酸探针不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。1.基因探针人基因组中某一基因的一个片段。常用于研究人类遗传性疾病。影响RFLP的几个因素2.随机探针从人基因组DNA中随意挑选出一个DNA片段，其功能并不知道。采用统一的