第六章dna序列多态性分析.ppt

《第六章dna序列多态性分析.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第六章DNA序列多态性分析（AnalisisofSequencePolymorphism）一、掌握DNA序列多态性概念；了解DNA序列测定及多态性分析基本技术。熟悉法医学应用价值评价。二、了解等位基因特异性探针杂交技术基本原理、技术及方法、常用遗传标记系统。三、了解扩增片段限制性长度多态性（PCR-RFLP）分析的基本原理、技术、方法及常用遗传标记系统、法医学应用。四、了解MVR-PCR序列多态性分析技术的基本原理技术，常用遗传标记系统、基本分型方法及法医学应用。五、了解序列多态性的其他分析技术。教学要求核染色体STR分型局限性作案现场只发现有头发

2、或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核DNA含量很少或降解，无法进行STR分型。DNA序列多态性（DNAsequencepolymorphism）概念：基因组DNA核苷酸序列在不同个体间最本质的遗传差异，在特定的基因座上不同个体的等位基因之间由碱基序列差异构成的DNA多态性叫做序列多态性。同一个体的不同组织细胞中的基因组DNA序列是相同的，这是根据DNA序列认定同一性的前提条件。主要包括线粒体序列多态性和核基因组单核苷酸多态性。人类基因组计划完成，序列多态性的研究将成为新兴热点。序列多态性的检测方法经典测序技术（双脱氧核苷酸链终止法和化学裂解法

3、)等位基因（序列特异性）寡核苷酸探针杂交（ASO-PCR）技术扩增限制性片段多态性技术(PCR-RFLP)序列多态性分析技术（MVR-PCR）DNA芯片(DNAChip)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）变性高效液相色谱法(TmHPLC)焦磷酸测序技术微测序方法实时荧光定量PCR技术DNA测序的两种经典方法：双脱氧核苷酸链终止法（thechainterminationmethod）单链DNA分子的序列由与之互补的多核苷酸链的合成来判定，互补链在某一特定的核苷酸位置终止。化学降解法（chemicaldegradatio

4、nmethod）双链DNA分子被化学物质修饰后，在特定核苷酸位置被切开，从而确定DNA分子的序列。法医学上常用的序列多态性分析技术DNA序列分析——mtDNA分型PCR-ASO技术——HLA-DQAl基因座PCR-RFLP技术——ABO基因、mtDNA第一节双脱氧核苷酸链终止法测序Sanger测序及其改进方法Sanger双脱氧末端终止法（32P标记、放射自显影）PCR循环测序ＤＮＡ自动测序技术（标记引物或ddNTP）Sanger双脱氧链终止DNA测序法：利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学

5、家F.Sanger等人于1977年发明的。1980年诺贝尔奖金获得者F.SangerSanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出

6、基因序列在每一反应试管中，都加入一种互不相同的ddNTP和全部4种dNTP，其中ddNTP带有32P同位素标记。反应混合物样品加在聚丙烯酰胺凝胶中，按片段大小进行电泳分离。谱带的判读是从胶的底部开始，所得的核苷酸碱基顺序，与模板链为互补链。1.用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。2.选择一条与DNA单链互补的短链引物，引物先同单链模板复性3.引物的延长和合成阻断4个试管分别加入：模板、DNA聚合酶、dNTP-标记底物（32P等）终止剂不同ddATPddGTPddCTPddTTP4个试管中所有产物是一系列长度只

7、差一个核苷酸的聚合链4.电泳：ACGT次序4道凝胶高压电泳5.放射自显影得到直读图谱。Sanger双脱氧末端终止法测序过程链终止法对DNA多聚酶的要求酶活性高保证不会反应提前终止无5’→3’外切酶活性保证不切除新合成链的5’端，改变链长度，给读序造成误差有3’→5’外切酶活性校正引物3端错配碱基保证不切除新合成链的3’端，改变链长度，给读序造成误差测序的DNA多聚酶目前普遍采用的测序酶为Sequenase,来自T7噬菌体将DNA克隆到质粒载体这种方法是获得测序模板DNA最常用的方法。获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进行测序。优点：可

8、双向测序。缺点：样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会干扰测序。链终止反应要求单链作为模板如何得到单链DNA？将DN