《dna序列分析》ppt课件

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1、DNA序列分析DNA的序列分析有两种基本方法，Maxam-Gilbert化学降解法和Sanger氏酶学法。因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段DNA或基因组测序时，需要选用一定的策略。测序的策略有primerwalking，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用Sanger氏酶学法，但是在标记上作了改进。DNA测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。FredSanger发明的末端合成终止法(sanger法)WalterGilbert发明的化学裂解法Maxam-Gillbert法基因测序技术他们给DNA的

2、测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类基因组测序做出了卓越贡献。1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。

3、不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。测序的常用方法第一节Maxam-Gilbert化学降解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法。化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。该方法是用特定的化学试剂修饰不同的碱基，并在相应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的。一、基本原理将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理

4、，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。Maxam-Gilbert化学降解法测序原理图将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记.分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5‘端被标记的DNA片段.这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理

5、,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序二、化学降解法测序的基本步骤1）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。2）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。3）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。4）使标记片段变性为单链。5）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个

6、被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。6）电泳7）放射自显影8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。Maxam-Gilbert化学降解法测序原理如图二、化学降解法测序的基本步骤对待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记；用化学修饰剂修饰特定碱基，以便在该碱基处切断DNA片段，随机产生的一端被标记的、起始位点相同的、不同长度和以不同碱基结尾的DNA片

7、段群；凝胶电泳分离和放射线自显影及读列。Maxam-Gilbert法所用的化学技术碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性。A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子质子化,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键,从而导致脱嘌呤。C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去。C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶。化学法测序实例哌啶碱基体系化学修饰试剂化学反应断裂部位GA+GC+TCA>C硫酸二甲酯哌啶甲酸（pH2.0）肼+NaCl（1.5M）90C,

8、NaOH（1.2M）甲基化脱嘌呤打开嘧啶环打开胞嘧啶环断裂反应GG和AC和TCA和C三、化学修饰试剂表：Maxam-Gilbert化学降解法测序的常用化学试剂碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡