适于滞育期蚕卵的基因组DNA提取方法.pdf

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1、·试验研究·北方蚕业2012，33(1)13适于滞育期蚕卵的基因组DNA提取方法刘洋焦锋薛忠民苏超(西北农林科技大学蚕桑丝绸研究所，陕西杨凌712100)摘要家蚕以卵滞育，蚕卵保存时间长，取样方便，但是DNA含量较低，抽提较为困难，利用不多。从处于滞育期(丙z胚子前)的蚕卵中快速高效地获取基因组DNA，对于提高家蚕研究效率具有实用价值。本试验对两种SDS法和一种CTAB法的抽提效果进行比较，结果表明SDS—II提取效果较好，单粒蚕卵提取基因组DNA即可用作PCR模板，5粒蚕卵获得DNA可以基本满足分子生物学研究需要。关键词家蚕滞育期蚕卵DN

2、A抽提DNA提取是家蚕分子遗传学研究的基本技l_2家蚕基因组DNA提取术，也是品种鉴定和纯度检测研究中较为常见的1．2．1方法A(SDS—I)问题。现有的报道大多从丝腺[1]、蚕蛹口或转方法A(SDS—I)，参照夏庆友[1等的方法，青期蚕卵[7。中提取。尽管家蚕以卵滞育，从春略加改动。抽提过程为：①将蚕卵放人预冷的研蚕期制种结束到次年蚕种出库，蚕卵保存时间长，钵中，加入液氮快速研磨成细粉末，转移到加有取样方便，但滞育期DNA含量仅为58．2ng／粒0．5mL抽提缓冲液[10mmol／LTris—CI(pH卵，从滞育期蚕卵中抽提DNA较为困难

3、，因而不8．0)，0．1mol／LEDTA(pH8．0)，0．5SDS]的常采用。蚕卵解除滞育孵化前DNA含量可达离心管中，混匀；②加入蛋白酶K至终浓度100280ng／粒_7]，增加近5倍，因而从蚕卵中提取g／mL，55℃消化过夜；③加入等体积平衡酚，DNA，大多需要进行催青促使蚕卵发育以增加在冰上温和振荡20min左右；④12000rpm离心DNA含量。。以丝腺或蚕蛹为材料提取DNA10min，将上层水相转移至另一干净离心管中；⑤需要饲养家蚕，取样受到季节、时间和发育状态严用等体积的氯仿抽提一次，重复步骤④；⑥加入等格限制，准备过程较长

4、，影响因素较多，成本较高。体积的氯仿：异戊醇混合物(24：1)抽提一次，重本试验中使用3种DNA抽提方法进行对比，希复步骤④；⑦收集上清液转移至另一干净离心管望探索出适合滞育期蚕卵的基因组DNA提取方中，加0．2倍体积的5mol／LNaC1和2倍体积法，以免除蚕卵催青或饲养过程，达到快速高效的的2O℃无水乙醇，沉淀2O～30min，离心后去除目的。无水乙醇，用7O乙醇洗涤2次，12000rpm离心5min，室温下离心管倒置，干燥；⑧加ddHO1材料与方法使DNA完全溶解后4℃保存备用。1．1供试材料1．2．2方法B(SDS—II)家蚕品种8

5、33的滞育期蚕卵，2010年春制平方法B(SDS-II)，参照李德葆编著的《基因附种。工程操作技术》的方法口，略加改动。抽提过程三异丙基乙磺酰(Tris)、十二烷基硫酸钠为：①取蚕卵放入预冷的研钵中，加入液氦研磨，(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯仿、平衡酚、乙将粉末加到0．5mL抽提缓冲液[10mmol／L醚、醋酸铵(NH4Ac)、无水乙醇、异戊醇等均为化Tris—Cl(PH8．0)，0．1mol／LEDTA(pH8．0)I学分析纯。蛋白酶K和RNase购自Sigma公司。中，混匀；加入5OL1OSDS，混匀；②加入蛋白收稿日期：2

6、012-01—15资助项目：西北农林科技大学基本科研业务费专项；国家蚕桑产业技术体系专项(No．cARS一22)作者简介：刘洋(1987一)，男，硕士研究生，研究方向为特种经济动物饲养。*通信作者：焦锋，博士，副教授。Email：fjiao@nwsuaf．edu．Cn14北方蚕业2012，33(1)·试验研究·酶K至终浓度100g／mL，37℃保温2h；③冲液为1×TAE。电泳后在凝胶成像仪上观察并(3)加入5OL5mol／LNaC1，混匀，12000rpm，照相。所有试验均设置3次以上重复。4℃，离心1min；④取上清液于新离心管中，用等

7、2结果与分析体积饱和酚，离心5min；⑤取上清液与等体积的氯仿：异戊醇(24：1)充分混匀，待分层后，再次2．1两种方法提取蚕卵DNA样品OD值离心；⑥取上清液至新离心管中，加入两倍乙醚抽对半蛾圈蚕卵利用方法A提取了1、2、3、4提(通风橱中操作)充分混匀，待分层，离心5号样品，方法B提取了5、6、7、8号样品。OD值min；⑦移去上层乙醚，保留下层水相；⑧加入1／测定见表1。方法B所提样品OD260／280比较10体积3mol／LNH4Ac以及两倍体积无水乙接近1．8，纯度较高。方法A所得样品纯度较差，醇，颠倒混合沉淀DNA。室温下静止2

8、Omin后OD值不稳定。形成絮状沉淀；⑨经过12000rpm5min离心，弃表1两种方法提取蚕卵DNA样品0D值去无水乙醇，经过70乙醇漂洗两遍，倒扣在吸方法样品号核酸浓度A26