水稻基因组DNA提取方法的研究-论文.pdf

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1、黑龙江农业科学2014(1)：7～1OHeiloniangAgriculturalSciences水稻基因组DNA提取方法的研究马文东(黑龙江省农业科学院佳木斯水稻研究所，黑龙江佳木斯154026)摘要：为探索分子标记辅助选择育种中快速有效的DNA提取方法，以水稻新鲜叶片、衰老叶片、水稻种子为材料，以CTAB法和SDS法为提取方法，利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测，对水稻基因组DNA提取方法和实验体系进行了优化和摸索。结果表明：新鲜叶片提取效果最好，其次是种子，再次是衰老叶片；CTAB法和SDS法差别不大；为避免酚类物质氧化污染，可在提取液中添加

2、p_巯基乙醇。关键词：水稻；基因组DNA；CTAB法；SDS法；分子标记辅助育种中图分类号：S511．035．3文献标识码：A文章编号：1002—2767(2014)01-0007—04传统的育种主要依靠植株的表现型进行选1材料与方法择，但其选择效率低、育种时间长，而分子标记辅1．1材料助育种依靠与目的基因紧密连锁的分子标记进行以水稻的种子、新鲜叶片和衰老叶片为供试选择，受其它效应和环境因素影响小，能够在早期材料。将水稻种子催芽后放于培养箱中，25℃培世代选择，缩短育种年限，提高选择效率。水稻分养7d获得水稻新鲜叶片。衰老的叶片于9月中子标记辅助育种已在实践中广泛应

3、用，关于不同旬采摘，保存于一80℃的冰箱中。种子为成熟种分子标记在水稻中的应用已有大量的研究子，室温保存，水分含量为l4。报道1]。1．2方法水稻基因组DNA的提取是分子标记辅助育1．2．1CTAB法提取水稻基因组DNA(1)分种过程中基础的实验技术之一，提取基因组DNA别取水稻幼嫩叶片、衰老叶片和种子放入液氮预的质量直接影响到后期分子生物学实验的结果。冷过的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，移入到对于水稻基因组DNA的提取已有相关研究报10mI离心管中；(2)将2CTAB提取缓冲液放道_9。】。水稻叶片和其它组织中含有大量的多糖入65℃的水浴中预热；(3)向离心管中加

4、入4mL和多酚等代谢产物，增加了提取高质量DNA的CTAB提取液混匀，65℃水浴3O～60min，其问困难。因此，优化水稻基因组DNA提取方法具每隔10min轻摇；(4)加入4mL的体积比为24：1有重要意义。的氯仿：异戊醇溶液于离心管中，置于摇床，该研究以水稻新鲜叶片、衰老叶片和种子为70r·min～，轻摇10min；(5)4℃，10000r·min。提取材料，采用CTAB法和SDS法提取水稻基因离心10min，将上清液转入一个新的10mI的离组DNA，利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳心管中(步骤4～5可重复2～3次)；(6)加人2倍进行DNA纯度检测。旨在获得

5、最佳提取部位以体积一2O℃预冷的无水乙醇，混匀，一2O℃放置及最优的提取方法，并提出改进意见，探索出分子30min；(7)10000r·min离心3min，弃上标记辅助选择育种中快速有效、高质量的DNA清；(8)70乙醇清洗，吹干；(9)将DNA溶于TE提取方法，为水稻分子辅助育种提供有效的技术溶液中；(10)向DNA原液中加人3LRnase支持。A(10mg·mL。)，置于37℃恒温培养箱中消化1～2h；(11)一2O℃保存待用。1．2．2SDS法提取水稻基因组DNA(1)分别收稿日期：2O13一O8—2l基金项目：国家“十二五”科技支撑计划资助项目(2011取水

6、稻幼嫩叶片、衰老叶片和种子放人液氮预冷BAD35B02-0101．2012BAD04B0l_01-01)作者简介：马文东(1980一)，男，黑龙江省桦南县人，硕士，助过的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，移入10mL理研究员，从事水稻遗传育种研究。E—mail：sdsmawendong离心管中，加入65℃预热的4mL的提取液；(2)@163．corn。65℃水浴30min，加入1mI5M醋酸钾(KAC)7黑龙江农业科学1期溶液，混匀后冰浴20～30min，不时震动以免成10×PCRBuffer2L，0．2mmol·L-dNTP0．3I，团；(3)加入体积比为24：1的氯

7、仿：异戊醇4mI，Taq酶(5U·tzI2)0．2『上L，0．4／xmmol·L引物充分混匀，室温下，10000r·min-离心5min；(4)3fI，模板DNA3L，ddH2010L。PCR反应吸取上清液于另一1OmL的离心管中，加入程序为：95℃预变性5rain，94℃变性40S，47℃退一2O℃预冷的0．6～1．0倍体积的异丙醇，缓慢混火40S，72℃延伸40S，循环3O次，72℃延伸5min，匀，使DNA成线团状沉淀析出；(5)4℃保存。10000r·min。离心3rain，倒掉上清液，加入2结果与分析70乙醇洗涤，吹干；(6)加入适量TE缓冲液2．1不