基因组dna提取方法

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时间:2018-01-28

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1、1快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min,丢去上清夜,收集菌体。B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70

2、%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4oC保存备用。2蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用WashingTE(50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0)洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml1×TE缓冲液中,先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次

3、,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。31)细菌培养:细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。2)细菌收集:取1ml培养物于1.5mlEP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1mlTE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。3)菌体裂解:加入6μl50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS110μl,20mg/ml的蛋白

4、酶K3μl,50℃作用3h或37℃过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)4)抽提:菌液均分到两个1.5mlEP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)5)沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。12000rpm离心10min。6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。7)抽(凉)干后,溶于50μlddH2O中,取2-5μl电泳。作PCR模板用。细菌基因组DNA的微量提取法本方法通过S

5、DS裂解细胞,蛋白酶降解蛋白,CTAB去除多糖成分一:仪器:同方法一二:试剂:TE、TAE缓冲液;10%SDS;5MNaCL;20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液(10%CTAB,0.7MNaCL4.1gNaCL溶于80ml水中,缓慢加入10gCTAB,加热溶解);25/24/1,酚/氯仿/异戊醇;24/1,氯仿/异戊醇;异丙醇;70%及100%乙醇三:操作1.5ml对数生长期细菌细胞离心,5000rpm,1min沉淀溶于500μlTE缓冲液中混匀30μl10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37℃,1小

6、时100μlNaCL(5M)混匀80μl的CTAB/NaCL,*混匀;65℃10min(可不做)加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心12000rpm,4-5min取上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。注意1,*此步操作后,离心管中NaCL的浓度不应低于0.5M,否则DNA将与CTAB共沉淀。2,本法适用于从多糖含量高的样品中提取DNA。对于菌体样品,通过此流程,可以获得较为完整的DNA分子。细菌总DNA的提取和鉴定【目的和要求】1.学会CTAB法提取细菌总DNA。2

7、.掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳法。【实验原理】DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的,因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后,必须将其中蛋白质去除。CTAB(溴代十六烷基三甲胺)是一种去污剂,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中可溶并且稳定存在,若降低盐浓度,CTAB与核酸的复合物会沉淀出来,而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于DNA分子或DNA片断的分子量差别,电泳后呈现迁移位置的差异。【实验试剂和器材

8、】(一)试剂:菌株(E.coli);蛋白酶K(20mg/ml);琼脂糖;标准DNA水解液1.10%SDS2.酚/氯仿/异戊醇(1/1/1)3.异丙醇;70%乙醇4.LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g加蒸馏水至1升,然后灭菌备用。5.TE缓冲液:10mMTris•HCl,0.1mMEDTA(pH8.0)。6.CTAB/NaCl溶液(5%w/v):5gCTA

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