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时间:2020-05-25
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1、实验一组培实验室常用洗涤灭菌方法一、实验目的和要求:植物组织培养是一项十分细致的工作,为了保证植物外植体不受污染,第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒,使它们保持无菌状态,做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧,因此每个学生必须学好这套基本功。在进行各类具体的组培实验前,首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的,总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。通过实际操作,学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、仪器设备:天平、烧杯、容量瓶、量筒、移液管、培养瓶、烘箱三、试
2、剂:过氧化氢、高车孟酸钾、漂白粉、次氯酸钠、酒精四、实验步骤:1.讲解实验室的构建情况。2.讲解内部仪器设备的名称及作用。3.组培实验室常用器械的洗涤和灭菌。(一)玻璃器皿的洗涤1.新购置的玻璃器皿的洗涤(学习、操作)因有游离碱性物质,使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜,然后用肥皂水洗净,清水冲洗,最后用蒸馄水冲洗一次,干后备用。2.已用过玻璃器皿先将残渣除去;用清水洗净,再用热肥皂水或洗衣粉洗净,清水冲洗干净,最后用蒸馅水冲洗一次,干后备用。3.对一些不宜刷洗的玻璃器皿如:吸管,滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗,自
3、来水冲干净后,晾干,再浸入硫酸一重铭酸钾洗液中浸泡若干小时,用夹子取出在自来水冲洗干净,再用蒸馄水冲洗1—3遍,稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。4.对带有凡士林,石蜡,或胶布的器皿选用特殊方法处理后,再用常规方法洗涤。带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去,再用汽油擦洗干净,然后用热肥皂水煮沸半小时,刷洗后,自来水冲干净。若带有石蜡,可在玻璃器皿下垫儿层废纸,放入60-70°C温箱中加热1—2小时,待石蜡融化后,再用废纸反复擦2-3次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗,蒸馅水冲洗干净若有胶布粘着物,先
4、用70%酒精棉球擦数遍,溶解粘胶物,并用少许去污粉刷抹,再用洗衣粉煮沸半小时,刷洗干净,自来水冲洗,晾干,再泡入洗液。(二)金属器皿新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油,用蘸有四氯化碳(CC14)布擦去油脂,再用湿布擦净,干燥备用。二、灭菌(一)器皿和用具常用灭gf方法:1.热压灭菌法(学习操作)将洗净的培养器皿,用具,用牛皮纸包好,放入高压消毒锅中,1.1个大气压下灭菌20-30分钟。2,干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中,I5O°C4O分钟或120°C两小时,待冷却后使用。(二)无幽室灭if(接种室、培养室)
5、1.紫外灯照射40min后,用新洁尔灭擦抹工作台,70%酒精擦拭超净工作台。2薰蒸(学习操作)用甲醛、高镒酸钾提前1—3天薰蒸密封房间方法1:甲醛倒入蒸发皿加热,用量10ml/m2o方法2:甲醛(HCHO)与高镐酸钾(KMn4)以10:1比例混合。3.接种前用70-75%酒精喷雾,使飘在空气中的尘埃沉积下来。4,用紫外光灯进行照射灭菌(波长2650-2660A最好)接种箱及用具30-40分钟。实验二MS培养基的制备及高压灭菌一、实验目的和要求:通过实验使学生认识掌握配置与保存培养基的基本技能。二、仪器设备:天平、烧杯、
6、容量瓶、量筒、冰箱、电炉、高压蒸汽灭举锅、移液管、培养瓶、标签。三、试剂:待配各种培养基的组成成分、琼脂、蔗糖四、实验步骤:1.母液的称取1.生长调节剂的量取2.固化剂的称取4.蔗糖的称取5.定容6.调pH7.分装8.灭菌培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的20倍或200倍分别称量,配成浓缩液,这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时,取其总量的1/20(50mL)或1/200(5mL),加水稀释,制成培养液。现将制备培
7、养基母液所需的各类物质的量列出,供配制时使用。大量元素(母液I)mg/LNH4NO333000KNO338000CaCl2•2H208800MgSO4•7H2O7400KH2PO43400微量元素(母液II)KI166H3BO31240MnS04•4H204460ZnS04•7H201720N&M0O4•2H2050CuS04•5H205CoCl2•6H205铁盐(母液III)FeS04•7H205560Na2-EDTA•2H207460有机成分(母液IV)IVA肌醇20000IVB烟酸100盐酸毗哆醇(维生素B6)1
8、00盐酸硫胺素(维生素B1)100甘氨酸400以上各种营养成分的用量,除了母液I为20倍浓缩液外,其余的均为200倍浓缩液。上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。其中,母液I、母液II及母液IV的配制方法是:每种母液中的几种成分称量完毕后,分别用少量的蒸馅水彻底溶解,然后再将它们混溶,最后定容到1Lo母液HI的配制方法是:将称好的
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