实验 植物组织培养技术.doc

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1、【实验目的】1.了解和掌握植物纽•织培养的方法及其要点。2.将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。3.将菊花花瓣培养成为完整小梢•株。【实验原理】植物组织培养的理论依据是植物细胞具冇全能性，所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达,产生出完整植株。要使细胞所具有的全能性表达出来，除了生长以外，还要经过脱分化和再分化等过程。分化了的植物根、茎、叶细胞，通过脱分化培养可以产生愈伤组织。愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。愈伤组织经过进一步的分化培养，提

2、供不同的营养和激素成分，又可再生出完整的小植株。植物组织培养技术，不仅具有巫大的理论意义，而且在生产实践中已显示了广泛的应用前景。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具分析天平、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱或培养室、剪刀、银子、手术丿J、电炉、烧杯、试剂瓶、培养瓶、酒精灯、精密pH试纸主要仪器、用具（见图8-1、8—2、8—3）（二）材料胡萝卜块根（见图8・4）、菊花花瓣（见图8・5）（三）试剂配制培养基的各种化学试剂药品（见表8-1）,6•节基氨基瞟吟（6-BA）、2,4・D、NAA、IMNaOH.1MHCk0.1%升汞、

3、酒精、蔗糖、琼脂【方法与步骤】（―）胡萝卜块根的脱分化培养1.母液的配制在呪制培养基时，为了使用方便，避免每次配制称杲的麻烦，通常将各种成分配成比培养基需:要杲大10-10Ox的母液（以MS为例，配制方法见下表）。表8-1MS培养基fi!方类型成分每升培养基中工作浓度（mg/L）配制母液称取量母液体积（ml）扩大倍数配一升培养基的吸取最（ml）大KN03190019000量NH4NO3165016500元MgSO4-7H2O3703700100010100索KH2PO41701700CaCI2-2H2O4404400微MnSO4

4、-4H2O22.32230ZnSO4-7H2O8.6860量H3BO36.2620KI0.8383100010010元Na2MO4-2H2O0.2525CuSO4-5H2O0.0252.5素COCI2-6H2O0.0252.5铁Na2-EDTA37.73770100010010盐FeSO4-7H2O27.82780有甘氨酸2.0100机盐酸硫胺索0.420物盐酸毗哆索0.5255005010质烟酸0.525肌醇1005000配制母液时必须要注意，各种化学物质必须一-充分溶解后才能混介，以避免药物间出现化学反应产生沉淀。某些生长素

5、,如2,4・D、IAA、NAA等，应先用少量95%乙醇溶解,最后才加水定溶。Kt、6・BA、2ip、ZT等细胞分裂素，应先用少量1MHCI或NaOH溶解，最后才加水定容。配好的母液要标记好配制口期以及药物的浓度。1.培养基的配制把母液按编号顺序排列好，取大烧杯一个，先加入约300ml蒸馆水，按设计好的培养基分别吸取母液，最后定溶到所需的量。调pH至5.8,每升培养基加入6.5g琼脂粉和30g蔗糖煮溶。分装到培养瓶中，封好瓶口。基本培养基种类和附加成分是根据培养材料和目的来确定的。卜一列培养基及附加成分可作为组织培养实验中参考依据

6、。MS培养基附加2,4-D2mg/L和6・BA0.2mg/L,适合胡萝卜块根愈伤组织的诱导；Miller或N6培养基附加2,4-D0.5mg/L,适合水稻花纱愈伤组织诱导;而附加NAA0.5-2mg/L和3mg/L6-BA则适合水稻花药愈伤纽织分化为单倍体植株。MS培养幕附加NAA0.1mg/L和6-BA3mg/L适合菊花花瓣诱导分化。MS培养基附加NAA0.5mg/L适合多种花卉植物的根分化。1.灭菌把分装好的培养基及接种川具放入高压消毒锅进行灭菌消毒。旳用力升到0.5kg/cm2时,打开放气阀，放气5min后，再把放气阀关上

7、，当压力升到1.1kg/cm2或0.11MPa时，开始计时，维持0.11MPa压力灭菌15-20mino灭菌后应把培养基放在干净处冷却待用。2.取材与消毒在白来水中反复冲洗干净胡萝卜块根，切取中间长约50mm-段，在超净工作台中，放入无菌烧杯中，经70%酒精浸泡5min后，用饱和漂门粉液消毒20~30min。倒去消毒液，用无菌水洗3〜5次。3.接种在超净工作台中，用经高压消毒过的银子和解剖刀把两端厚约10mm的部分切公不用，中间的-段切成库约5mm的圆片，最后把圆片切成5mm3的组织块（注意每块都应带仃形成层），接种在MS+2,

8、4-D2mg/L+6BA0.2mg/L的培养基中。接种后，要在包头纸上写清材料名称、培养基代号、接种日期、姓名等。4.培养接种好的材料放在26-28°C条件卜黑暗培养2-3周，即可出现愈伤组织，培养4〜6周，愈伤组织达到高峰。每隔一周。观察记录培养物的形态变化。