利用GUS基因表达观察启动子功能b.ppt

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1、利用GUS基因表达观察启动子功能一、实验目的1.了解报告基因及其应用；2.学习启动子功能研究的方法。二、实验原理1.启动子（Promoter）启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列，能作为RNA聚合酶的结合位点，同时也是转录因子结合的位点。分子生物学上,把启动子称作顺式调控元件,把转录因子称作反式作用因子。在真核生物中，通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测。Thepromoterregioninhighereukaryotes.TheTATAboxis

2、locatedapproximately30basepairsfromthemRNAstartsite.Usually,twoormorepromoter-proximalelementsarefound100and200bpupstreamofthemRNAstartsite.TheCCAATboxandtheGC-richboxareshownhere.OtherupstreamelementsincludethesequencesGCCACACCCandATGCAAAT.Thecorepromoter,promot

3、er-proximalelements,anddistance-independentelementsareallDNAsitesthatarerecognizedbysequence-specificDNA-bindingproteins.Theproperconstellationofsuchtrans-actingproteinsisrequiredforRNApolymeraseIItoinitiatetranscriptionandtoachievemaximalratesoftranscription.The

4、molecularapparatuscontrollingtranscriptioninhumancells是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而筛选得到转化体，并利用它的表达产物来研究目的基因的表达调控。主要用于：转化子的鉴定基因表达调控的研究：基因表达的组织特异性；不同发育阶段基因表达的特点；内外环境因子对基因表达的影响等。2.报告基因（reportergene）报告基

5、因一般具备以下特点：（1）报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。选择何种报告基因系统是根据研究的目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性，以及首选的检测方法而定。目前，报告基因技术已被广泛应用到高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及生物传感器的构建以及基因的调控与功能的研究中。常用的报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素转乙酰酶基因（cat）新霉素磷酸转移酶基因（npt

6、-II)绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱合成酶基因β-半乳糖苷酶基因3.β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因GUS由uidA编码，其产物是葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。GUS检测方法：组织化学染色定位法(定性)能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物。荧光法（定量）以4-甲基伞形酮酰－β－D葡萄糖醛酸苷为底物，GUS催化其水解为4－甲基伞形酮及β－D葡萄糖醛酸。4－甲基

7、伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。4.吲哚乙酸（IAA）吲哚乙酸（IAA）是最早发现的激素（auxin），这是一种生长素，它是研究最多的一种激素。吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。5.本实验原理1）将IAA2promoter与GUS相连后导入拟南芥。转基因植物进行GUS染色，观察到的GUS表达位点。gusIAA2promoterNos-terIAAmRNA2）观察GUS表达的组织特异性：观察不同组织（根，叶等）GUS活性的强弱。出现蓝色的地方即就

8、是IAA2启动子工作的地方。3）影响基因表达的因素：影响GUS表达的因素就是影响IAA2启动子功能的因素。如：外源生长素处理。实验中,我们将在根冠和原韧皮部看到蓝色，因此生长素是影响这个启动子工作的因子之一。其它基因的影响：可以将IAA2promoter-GUS的转基因植物和一些突变体杂交,研究在某些基因突变的条件下