欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:55628813
大小:791.00 KB
页数:29页
时间:2020-05-21
《利用GUS基因表达观察启动子功能b.ppt》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在PPT专区-天天文库。
1、利用GUS基因表达观察启动子功能一、实验目的1.了解报告基因及其应用;2.学习启动子功能研究的方法。二、实验原理1.启动子(Promoter)启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列,能作为RNA聚合酶的结合位点,同时也是转录因子结合的位点。分子生物学上,把启动子称作顺式调控元件,把转录因子称作反式作用因子。在真核生物中,通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用,对基因表达进行调控。启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测。Thepromoterregioninhighereukaryotes.TheTATAboxis
2、locatedapproximately30basepairsfromthemRNAstartsite.Usually,twoormorepromoter-proximalelementsarefound100and200bpupstreamofthemRNAstartsite.TheCCAATboxandtheGC-richboxareshownhere.OtherupstreamelementsincludethesequencesGCCACACCCandATGCAAAT.Thecorepromoter,promot
3、er-proximalelements,anddistance-independentelementsareallDNAsitesthatarerecognizedbysequence-specificDNA-bindingproteins.Theproperconstellationofsuchtrans-actingproteinsisrequiredforRNApolymeraseIItoinitiatetranscriptionandtoachievemaximalratesoftranscription.The
4、molecularapparatuscontrollingtranscriptioninhumancells是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因,也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而筛选得到转化体,并利用它的表达产物来研究目的基因的表达调控。主要用于:转化子的鉴定基因表达调控的研究:基因表达的组织特异性;不同发育阶段基因表达的特点;内外环境因子对基因表达的影响等。2.报告基因(reportergene)报告基
5、因一般具备以下特点:(1)报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物;(2)受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测;(3)报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。选择何种报告基因系统是根据研究的目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性,以及首选的检测方法而定。目前,报告基因技术已被广泛应用到高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及生物传感器的构建以及基因的调控与功能的研究中。常用的报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)氯霉素转乙酰酶基因(cat)新霉素磷酸转移酶基因(npt
6、-II)绿色荧光蛋白基因(gfp)冠瘿碱合成酶基因β-半乳糖苷酶基因3.β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因GUS由uidA编码,其产物是葡萄糖苷酶(β-glucuronidase),该酶是一种水解酶,能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。GUS检测方法:组织化学染色定位法(定性)能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物。荧光法(定量)以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷为底物,GUS催化其水解为4-甲基伞形酮及β-D葡萄糖醛酸。4-甲基
7、伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发,产生455nm的荧光,可用荧光分光光度计定量。4.吲哚乙酸(IAA)吲哚乙酸(IAA)是最早发现的激素(auxin),这是一种生长素,它是研究最多的一种激素。吲哚乙酸在植物体内普遍存在,是生理活性最强的生长素。5.本实验原理1)将IAA2promoter与GUS相连后导入拟南芥。转基因植物进行GUS染色,观察到的GUS表达位点。gusIAA2promoterNos-terIAAmRNA2)观察GUS表达的组织特异性:观察不同组织(根,叶等)GUS活性的强弱。出现蓝色的地方即就
8、是IAA2启动子工作的地方。3)影响基因表达的因素:影响GUS表达的因素就是影响IAA2启动子功能的因素。如:外源生长素处理。实验中,我们将在根冠和原韧皮部看到蓝色,因此生长素是影响这个启动子工作的因子之一。其它基因的影响:可以将IAA2promoter-GUS的转基因植物和一些突变体杂交,研究在某些基因突变的条件下
此文档下载收益归作者所有