利用gus基因表达观察启动子功能

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1、实验七利用GUS基因表达观察启动子功能一、实验目的1.了解报告基因及其应用；2.学习启动子功能研究的方法。1.真核基因转录调控的基本原理在真核生物中，通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用，对基因表达进行调控。二、实验原理顺式调控元件启动子Promoter增强子Enhancer/沉默子Silencer能被序列特异性DNA结合蛋白识别的DNA位点为RNA聚合酶II启动转录及实现最大转录效率所需反式作用因子是一些能结合核心启动子和启动子近端元件的调控蛋白，能协助RNA聚合酶II启动转录，并与聚合酶形成启动复合物。基本转录因子Basaltranscriptionfactors活化子Acti

2、vators/抑制子repressorsThemolecularapparatuscontrollingtranscriptioninhumancells2.启动子（Promoter）启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列，能作为RNA聚合酶的结合位点，同时也是转录因子结合的位点。启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测。是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因。将某个基因表达调控序列与报告基因编码序列相融合，利用报告基因表达研究该基因表达调控。利用报告基因与其它目的基因融合蛋白的表达，进行蛋白定位。3.报告基因(reportergene)报告基因的特点：报告基因产物必须区别于转染前

3、真核细胞内任何相似的产物；受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。常用的报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素转乙酰酶基因（cat）新霉素磷酸转移酶基因（npt-II)绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱合成酶基因β-半乳糖苷酶基因绿色荧光蛋白基因green-fluorescentprotein,gfp一种腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在一定波长的紫外线激发下发出绿色荧光。优点：1.适用于各种生物的基因转化；2.检测方法简便，无需底物、酶、辅因子等物质；3.便于活体检测，十分利于活体内基因表达调控的研究。L

4、aserablationofthequiescentcenter（静止中心）inthepost-embryonicroot(后胚根).Confocalscanningimages(共聚焦扫描成像)fromthesameroot.拟南芥根部GFP的表达β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因由uidA编码，其产物是葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。GUS检测方法组织化学染色定位法(定性)能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物。荧光法（定量）以

5、4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮及β-D葡萄糖醛酸。4-甲基伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。GUSactivityintheshootofArabidopsis中柱内皮皮层表皮GUSactivityintheshootofArabidopsisA:maturetrichomes(表皮毛）;C,cotyledonguardcells(子叶和保卫细胞);D,stipules（托叶）;H,veinsofcotyledonandhypocotyl(胚轴);N,veinsofhypocotyl

6、andcotyledonpetiole（叶柄）;P,cotyledonandleafblade(子叶和叶片)Scalebars100m.本实验原理简介植物激素(Auxin)能调控植物生长和发育的各个方面，包括细胞分裂(celldivision)、细胞伸长(cellelongation)、细胞分化(celldifferentiation)和器官形成(theinitiationoforganformation)等。吲哚乙酸(IAA)在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。Aux/IAAgenesAux/IAA基因家族编码18-to35-kD的短命转录因子，加入生长素5~60分钟后，大部

7、分AUX/IAA家族就表达。这类基因的启动子区含有TGTCTC生长素反应元件(auxin-responsivepromoterelements，AuxREs)。1.构建ProIAA2::GUS转基因拟南芥，利用GUS染色反应，观察IAA2基因表达的组织特异性及外源生长素对IAA2基因表达的影响。GUSIAA2promoterNos-terIAAmRNA本实验内容观察GUS表达的组织特异性：观察不同组织（根，叶等）GUS活性的强弱。出现蓝色的地方