遗传学实验 用gus基因表达观察启动子功能

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1、用GUS基因表达观察启动子功能摘要通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。1.引言在真核生物中，主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（T

2、sVP1）在除了种子以外的所有组织中都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列，构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）不同长度启动区控制的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）载体pCAMBIA1391z（PTsVP::GUS），转染拟南芥，获得转基因拟南芥PT1，PA1和P7。发现PT1，PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点。2.实验材料2.1实验材料2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂

3、配制MS培养基所需的母液，琼脂，蔗糖，1mol/L的NaOH溶液，70％乙醇，无菌水，10％次氯酸钠，琼脂粉，NaCl，1mol/LGUS染色液。2.1.1器具量筒，移液枪，烧杯，天平，玻璃棒，滴管，pH计，500mL锥形瓶，高压蒸汽灭菌锅，培养皿，EP管，人工培养箱，吸管，吸水纸。2.2实验方法2.2.1配制MS培养基MS培养基：Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用

4、范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 MS培养基组成：成分分子量使用浓度(mg/L)大量元素硝酸钾　KNO3101.111900硝酸铵　NH4NO380.041650磷酸二氢钾　KH2PO4136.09170硫酸镁　MgSO4.7H2O246.47370氯化钙　CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化钾　KI166.010.83硼酸　H3BO361.836.2硫酸锰　MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌　ZnSO4.7H2O287.548.6钼酸钠　Na2MoO4.2H2O241.

5、950.25硫酸铜　CuSO4.5H2O249.680.025氯化钴　CoCl2.62237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠　Na2.EDTA372.2537.3硫酸亚铁　FeSO24.7H2O278.0327.8有机成分肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素　VB10.1盐酸吡哆醇　VB60.5烟酸　VB5或VPP0.5蔗糖　sucrose342.3130g/L琼脂　agar7g/L配制母液的优点是：1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。2、减少了称量微量元素造成的误差。配制MS培养基：（1）用量筒和移液枪从各种母液中分别

6、取出所需的用量：母液Ⅰ（大量元素20×）为10mL，母液Ⅱ（微量元素200×）、Ⅲ（铁盐200×）、Ⅳ（有机成分200×）各1mL，加入烧杯中，再加入蔗糖6g，加蒸馏水至175mL左右。（2）用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH计测培养液的pH，一直到pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。（3）在大量筒中定容至200mL，倒入锥形瓶，加入1.6g琼脂粉。（4）同样的方法配制200mL含盐的培养基，在第（1）步中加入2.34gNaCl。（5）称0.00

7、5g左右的琼脂粉与10mL蒸馏水混合，配成0.05%琼脂液。（6）高压灭菌第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98kPa、121.3℃下，灭菌20min。第四，灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固，或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗（1）培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化，在超净工作台上将其趁热倒

8、入四个培养皿，令其自然冷却凝固。（2）种子灭菌种子在EP管内经体积分数70％乙醇漂洗lmin，无菌水洗l次，等量无菌水和10％次氯酸钠混合浸洗10min，无菌水洗5遍，最后加入质量分数0．05％的琼脂液悬浮，分别均匀撒于平板上。（3）适宜环境培养培养条件：在人工