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时间:2018-08-05
《遗传学实验 用gus基因表达观察启动子功能》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、用GUS基因表达观察启动子功能摘要通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。1.引言在真核生物中,主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用,对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内,编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶,以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物,其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现,盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(T
2、sVP1)在除了种子以外的所有组织中都有活性,它的活性在根和叶中能被盐诱导,尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列,构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVP1)不同长度启动区控制的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)载体pCAMBIA1391z(PTsVP::GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1,PA1和P7。发现PT1,PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响,由此推测启动子的关键序列及诱导特点。2.实验材料2.1实验材料2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂
3、配制MS培养基所需的母液,琼脂,蔗糖,1mol/L的NaOH溶液,70%乙醇,无菌水,10%次氯酸钠,琼脂粉,NaCl,1mol/LGUS染色液。2.1.1器具量筒,移液枪,烧杯,天平,玻璃棒,滴管,pH计,500mL锥形瓶,高压蒸汽灭菌锅,培养皿,EP管,人工培养箱,吸管,吸水纸。2.2实验方法2.2.1配制MS培养基MS培养基:Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的,其特点是无机盐和离子浓度较高,是较稳定的离子平衡溶液,它的硝酸盐含量高,其养分的数量和比例合适,能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用
4、范围比较广,多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 MS培养基组成:成分分子量使用浓度(mg/L)大量元素硝酸钾 KNO3101.111900硝酸铵 NH4NO380.041650磷酸二氢钾 KH2PO4136.09170硫酸镁 MgSO4.7H2O246.47370氯化钙 CaCl2.2H2O147.02440微量元素碘化钾 KI166.010.83硼酸 H3BO361.836.2硫酸锰 MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌 ZnSO4.7H2O287.548.6钼酸钠 Na2MoO4.2H2O241.
5、950.25硫酸铜 CuSO4.5H2O249.680.025氯化钴 CoCl2.62237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA372.2537.3硫酸亚铁 FeSO24.7H2O278.0327.8有机成分肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素 VB10.1盐酸吡哆醇 VB60.5烟酸 VB5或VPP0.5蔗糖 sucrose342.3130g/L琼脂 agar7g/L配制母液的优点是:1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。2、减少了称量微量元素造成的误差。配制MS培养基:(1)用量筒和移液枪从各种母液中分别
6、取出所需的用量:母液Ⅰ(大量元素20×)为10mL,母液Ⅱ(微量元素200×)、Ⅲ(铁盐200×)、Ⅳ(有机成分200×)各1mL,加入烧杯中,再加入蔗糖6g,加蒸馏水至175mL左右。(2)用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用pH计测培养液的pH,一直到pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。(3)在大量筒中定容至200mL,倒入锥形瓶,加入1.6g琼脂粉。(4)同样的方法配制200mL含盐的培养基,在第(1)步中加入2.34gNaCl。(5)称0.00
7、5g左右的琼脂粉与10mL蒸馏水混合,配成0.05%琼脂液。(6)高压灭菌第一,码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内。第二,放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。第三,灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖。在98kPa、121.3℃下,灭菌20min。第四,灭菌后取出锥形瓶,让其中的培养基自然冷却凝固,或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗(1)培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化,在超净工作台上将其趁热倒
8、入四个培养皿,令其自然冷却凝固。(2)种子灭菌种子在EP管内经体积分数70%乙醇漂洗lmin,无菌水洗l次,等量无菌水和10%次氯酸钠混合浸洗10min,无菌水洗5遍,最后加入质量分数0.05%的琼脂液悬浮,分别均匀撒于平板上。(3)适宜环境培养培养条件:在人工
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