抗人Glypican3 N端融合蛋白单克隆抗体研制及特性鉴定.pdf

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1、ISSN1007—8738细胞分r免疫：杂志(ChinJCellMollmmuno1)2011，27(6657·论著·文章编号：1007—8738(2011)06—0657—02抗人Glypican3N端融合蛋白单克隆抗体研制及特性鉴定肖明兵，江枫，倪润洲，朱净，陆翠华，周嘉伟(南通大学附属医院消化病研究室，江苏南通226001；中国科学院上海神经科学研究所，上海200030)[摘要]目的：制备抗人磷脂酰蛋白聚糖3(Glypican3，白分3次对BALB／c小鼠进行免疫：第1次按100仙只，GPC3)N端蛋白的单

2、克隆抗体(mAb)，并进行特性鉴定。GPC3N端蛋白(免疫原)加完全福氏佐剂乳化后，腹腔注射；方法：以纯化的GPC3N端融合蛋白免疫BALB／c小鼠，应用间隔3周进行第2次免疫，除佐剂为不完全福氏佐剂外，余淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人GPC3N端mAb并进行纯化。均同第1次；再隔2周进行第3次免疫，即将免疫原按30经Westernblot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚类和效价。只直接脾脏内注射，3d后行细胞融合。(2)细胞融合、筛选结果：获得2株可稳定分泌抗人GPC3N端mAb的杂交瘤细及克隆化：①饲养细胞制

3、备：小鼠拉颈处死，消毒后放人超胞株(III4B，XII6C)。两株mAb均为Igl亚类，其腹水mAb的净台，撕开腹部皮肤(勿撕破腹膜)，用注射器经腹膜注入效价分别为1：9600及1：7200，均可特异性地识别GPC3蛋10mL基础培养液。静置5min后，再抽回含有饲养细胞的培白。结论：成功地建立可稳定分泌抗人GPC3N端mAb的杂养液，细胞清洗2次后，以HAT培养液配成2×10／L加入交瘤细胞株，其分泌的mAb特异性强、效价高。96孔培养板中，每孔0．1mL；②细胞融合：免疫后小鼠脾细[关键词]磷脂酰蛋白聚糖3；

4、单克隆抗体；特性鉴定胞和Sp2／0细胞比例参照文献，按5：1比例在500g／L聚乙[中图分类号]Q813．2[文献标识码]B二醇(PEG，M1000)促融下按常规方法进行融合后，悬于含HAT选择性培养液，种人含饲养细胞的96孔板中，长出细胞磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)属于克隆后2周，逐渐换成同量HT培养液培养；⑧杂交瘤细胞株细胞膜上硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖家族中的一员，的筛选：采用间接ELISA法筛选阳性孔。自1996年Pilia等¨最早克隆了其基因以来，研究显1．2．2mAb腹水的制备及纯

5、化每只BALB／c小鼠腹腔注示其在体内的作用机制和生物学功能复杂，并与多射无菌液体石蜡0．5mL，1周后每只小鼠腹腔接种杂交瘤细种肿瘤的发生发展相关-3]。GPC3N端为可溶性蛋胞6×10。个。8～10d左右，采集腹水，用辛酸一硫酸铵盐析法纯化mAb，以0．01mol／LPBS(pH7．4)重悬后，透析过白，其在组织中表达时，易于分泌入血而被检测，从夜进行蛋白定量，过滤除菌后加等量甘油，分装，于一80~C而有益于肿瘤的诊断。作者曾首次研究了GPC3N冻存。端蛋白的表达。，并对表达的融合蛋白进行了纯1．2．3mAb

6、的特性鉴定(1)腹水mAb的效价测定：将腹水化。本研究采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人梯度稀释后，用间接ELISA法检测mAb的效价。(2)mAbIgGPC3N单克隆抗体(mAb)，并进行了特性鉴定，为亚类的鉴定：按小鼠Ig亚类鉴定试剂盒的操作说明进行鉴肝癌的血清学诊断提供了重要的制剂。定。(3)mAb的特异性鉴定：采用Westernblot进行鉴定。将GPC3N端融合蛋白(0．5g／孔)、肝癌组织匀浆上清液(蛋白1材料和方法浓度4．1mg／ml，20L／孔)及PGEX4T-1空载体蛋白(0．5g／1．1材料纯化

7、的GPC3N端蛋白为本室自制。6—8周龄雌孔)进行SDS—PAGE，并电转移至硝酸纤维素膜上。滴加性BALB／c小鼠8只由上海中科院实验动物中心提供。Sp2／050L脱脂奶粉室温封闭过夜后，依次滴加1：500mAb(孵育小鼠骨髓瘤细胞购自中科院上海细胞保藏中心。96孔与241h、洗涤)及1：5000HRP一羊抗鼠IgG(孵育1h，洗涤)后，用孔细胞培养板为美国Costar公司产品。小牛血清购自上海中ECL化学发光剂1000IxL敷膜约2min，于暗室曝光到x光科院细胞所实生公司。HAT、HI"、福氏佐剂、3，3，

8、5，5一四甲基胶片上，显影、定影，观察结果。联苯胺(TMB)及HRP一山羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。亚类鉴定试剂盒购自Serotech公司。硝酸纤维膜为美国LifeScience2结果公司产品。ECI一Westernblot试剂盒购自美国Tropix公司。2．1杂交瘤细胞株的建立细胞共融合768孔，248孑L有杂1．2方法交瘤细胞生长，融合率为32．3％。将阳性孔克