资源描述：
《抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定作者：周群芳，鞠吉雨，郎景和【摘要】目的：制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究。方法：构建OPN的原核表达载体pTriEx1hONP载体,转化Tuner(DE3)placT感受态大肠杆菌,用TPTG进行诱导表达。利用镣柱亲和层析纯化OPN蛋白，纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选，获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的
2、杂交瘤细胞株，通过ELISA、Westernblot等方法检测其特异性，并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜0PN的表达。结果：pTriEx1hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式，经镣柱纯化后，蛋白纯度可达85%以上。纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选，得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和5B7,两株mAb的免疫球蛋白亚类分别TgGl和IgG2ao通过ELISA和Westernblot等方法鉴定,抗0PN的mAb能与0PN蛋白特异性结合。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的0P
3、N的检测表明，子宫内膜腺上皮在增生期、分泌早期，0PN呈弱阳性表达；分泌中、晚期0PN呈强阳性表达。结论：以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb,并初步进行了应用，为研究hOPN的功能打下了良好基础。【关键词】骨桥蛋白；原核表达；单克隆抗体骨桥蛋白(osteopontin,0PN)是一种机体反应性的多功能磷酸化糖蛋白，具有精氨酸甘氨酸天冬氨酸(arginineglycineasparticacid,RGD)序列，可通过该序列与整合素和CD44结合,参与细胞的黏附、迁移等［1L0PN功能复杂多样，与免疫系统、肿瘤转
4、移、消化系统、泌尿系统、生殖系统、骨组织等关系密切，参与疾病的发生［2,3L近年来有学者发现子宫内膜、蜕膜等生殖系统也表达OPN,0PN在胚胎的着床、生长发育及分化等方面也起着重要作用，因此0PN在生殖系统疾病中的作用值得近一步研究［4］。我们通过构建0PN的原核表达载体，表达纯化0PN蛋白并制备小鼠抗人0PN蛋白单克隆抗体(mAb)9用于0PN的检测，以进一步研究0PN与生殖疾病的关系。1材料和方法1.1材料克隆用大肠杆菌DH5oc本室保存。表达质粒pTriEx1、含人OPNcDNA的质粒pET28ahOPN及表达用大肠杆菌Tun
5、er(DE3)placI由哈佛大学刘思金博士惠赠。6-8周龄的BALB/c小鼠(雌性)，购自中国医学科学院动物所。1.2方法1.2.1表达载体的构建根据OPN基因序列NCBT(AccessionNumber:NM_000582)设计一对扩增引物扩增人OPN基因编码序列全长：PCR上游引物P1为5，CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3，,引入SacI酶切位点，下游引物P2为5，GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3,引入XhoI酶切位点。扩增部分为hOPNcDNA序列(AccessionN
6、umber:NM.000582)的2741065位核普酸。以pET28ahOPN为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为94°C预变性3min,然后94°C45s,55C45s,72°C1min循环，共30个循环，最后72C延伸10min,PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后和pTriEx1均以SacI和Xh。I酶切并纯化，二者用T4DNA连接酶16C连接过夜，转化大肠杆菌DH5a,将菌液涂布于含100mg/L氨卞青霉素的LB平板，筛选阳性克隆并进一步用PCR和测序进行鉴定。1.2.2OPN蛋白的诱导表达和纯化挑取鉴定正确的pTriEx1
7、hONP质粒转化大肠杆菌Tuner(DE3)placl,挑取单个阳性克隆接种于含有5mLLB培养基(含氨节青霉素100mg/L,10g/L的葡萄糖)中，37°C250r/min摇菌至A值达0.5左右时，加入浓度为1mmol/L的TPTG,诱导3h后离心收集菌体，同时在诱导前取样作为对照。收集的菌体经超声裂解后取上清和沉淀分别进行SDSPAGE电泳，考马斯亮兰染色分析。按上述方法对pTriEx1hONP进行大量诱导表达蛋白，取出培养物5000r/min离心收集细胞，超声破碎细胞，镣离子金属鳌合柱（NiNTA）纯化目的蛋白，收集洗脱液,
8、经SDSPAGE鉴定后超滤管超滤浓缩洗涤后备用。1.2.3鼠抗人OPNmAh的制备纯化后的OPN抗原与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分搅拌直至成为油包水，腹部皮下多点注射。每只小鼠注射20ug抗原，共注射5只小鼠。2周后同剂量抗原加福氏
