抗人dcr3单克隆抗体的研制及其鉴定

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1、抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定：吴春风,马忠森,王秀丽,杨俊玲,杨洋,张越,图们乌力吉,乔俊华【摘要】　　目的:制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb）,并鉴定其特异性。方法:纯化的HisDcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3mAb并进行纯化,纯化后的抗体经:Topreparemonoclonalantibodies(mAbs)againsthumanDcR3andidentifytheircharacterization.METHODS:BALB/cmicemunizedAbsagainstDcR3a

2、techniqueacelllinessecretingmAbsagainsthumanDcR3inedasIgG1subtypeandascitestitersoffivemAbsagainstDcR3reached1×10-5-1×10-7.FivemAbsAbsagainstDcR3entofELISAkit.　　[Keyonoclonalantibody;preparation　　诱骗受体3(decoyreceptor3,DcR3,又称TR6)为近年新发现的一种可溶性肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员,可竞争性结合肿瘤坏

3、死因子(TNF)成员LIGHT、FasL及TL1A[1,2],但并不介导细胞凋亡,在细胞的生长、分化、死亡以及免疫调节等方面发挥重要作用,与肿瘤、自身免疫疾病、移植排斥等密切相关。应用DcR3抗体研究DcR3在上述病变组织或细胞中的表达现已成为研究热点。目前,国外已有商品化的抗人DcR3mAb,但价格昂贵,国内尚无这方面的研究报道。我们运用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人DcR3mAb,并进行了鉴定,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料纯化的HisDcR3融合蛋白为本室自制[

4、3];RPMI1640购自Hyclone公司;PEG4000购自Merck公司;HAT、HT购自Sigma公司;HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG抗体购自SantaCruze公司;抗体亚类测定试剂盒购自Serotech公司;ProteinA亲和层析胶购自Pierce公司;PVDF膜购自Amresco公司;ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司。Sp2/0细胞株取自东北师范大学细胞遗传所;高表达DcR3的人结肠癌SI1640不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数。制备免疫小鼠脾细胞悬液,将Sp2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混

5、合,37℃水浴500mL/LPEG4000作用下进行融合,融合后1000r/min离心8min,弃上清,用含有饲养细胞的HAT选择培养液轻轻混悬,接种在96孔细胞培养板中,置37℃、50mL/LCO2培养箱培养。第10天换HT选择培养液,第14天换含200mL/L胎牛血清的RPMI1640完全培养液。(2)筛选及克隆化:2～3周后当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10以上时,分别包被HisDcR3融合蛋白与His蛋白,同时设立阴、阳性及空白对照,应用间接ELISA方法检测培养上清液。以P/N≥2.1为阳性,选取与HisDcR3融合蛋白

6、反应阳性而与His蛋白反应阴性孔的细胞通过有限稀释法连续克隆2～3次,直至所有单个克隆细胞阳性孔率为100%时扩大培养,进行细胞冻存和腹水制备。（3）腹水制备及纯化:每只BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡500μL,7d后每只鼠腹腔接种杂交瘤细胞6×105个,14d左右采集腹水。SiO2吸附法对腹水进行预处理,采用辛酸饱和硫酸铵沉淀法[4]、ProteinA亲和层析进行纯化,紫外分光光度法测定纯化后mAb含量,纯化后mAb过滤除菌加等量甘油,分装-70℃冻存。　　1.2.3mAb的鉴定（1）效价的测定:将纯化前后的mAb倍比稀释

7、,以1∶200稀释的正常小鼠血清作为阴性对照,应用间接ELISA方法测定A492,以P/N≥2.1为阳性。（2）免疫球蛋白类和亚类的鉴定:按操作说明将杂交瘤上清1∶200稀释,取150μL稀释液加入含有亚类定性试剂的试管底部,30s后将试纸条插入管底,5～10min后观察结果,判读轻链、重链。(3)杂交瘤细胞染色体核型分析:生长良好的杂交瘤细胞悬液10mL加入秋水仙素,使其终浓度为0.1mg/L,继续培养3h,1000r/min离心10min,重蒸水室温低渗处理20min,离心弃上清,细胞固定后Gimsa染色,油镜下观察染色体计数。

8、（4）相对亲和力鉴定:参照文献[5]。采用非竞争ELISA方法确定单克隆抗体的亲和力。分别以不同浓度（1、5、10g/L）的纯化的DcR3融合蛋白为固相,加入倍比稀释的纯化mAb及HRP标记的羊抗小鼠IgG,以OPD为底物测定A492