抗人脑钠肽单克隆抗体的研制

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1、毒京医科大学颤。}学位论文抗人脑钠肽单克隆抗体的研制背景：流行病学调查显示，心力衰竭在成人住院病溜中排名第四，严重危害着人类健康。自脑钠膝(brainnatriureticpeptide，BNP)被发统以来曩今，BNP在心力衰竭、急性冠脉综合征等疾病中的诊断价值、判断预后价值等已经得到了广大学者的认可，美国心脏编学会、欧洲心脏病学会也分鄹特BNP捡瀵{列入其心力衰竭诊疗搂南，BNP有望成为心力袭竭诊断、危险分层、预后评判的标记物。目的：建立分泌BNP单克隆抗体杂交瘤细胞株，制备抗人BNP单克隆抗

2、体，为建立BNP检测方法及其临床应用提供基础。穷法：合成翡BNP与字盆清交蛋巍(bovineserumalbumin，BSA)以碳化_7-乙胺(EDC)法偶联，制备BNP-BSA完全抗原。将BNP．BSA(100耻gBNP)与等体积福氏完全佐剂混合后，腹腔注射Balb／c小鼠初次免疫，3阁后以BNP．BSA与等体积福氏不完全佐剂混合继续加强免疫小鼠，共加强免疫3次，每次溺隔3震。免疫完成后2周对小鼠采血，阗接酶联免疫吸附实验(enzyme．1inkedimmunosorbentassay，ELI

3、SA)法检测小鼠血清BNP抗体滴度。掇融合前3天以无佐剂的100p．g完全抗原再次加强免疫。约1×108个免疫小鼠脾细胞在聚乙二醇作用下，与2-5x107骨髓癌细施SP2／0鼓各。融合后纽跑先君培养子次黄嘌呤、畿基喋呤、驹骧嘧啶核苷(hypoxanthine、aminopterin、thymidine，HAT)以及次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)选择性培养液。培养lo天后间接ELISA法检测细胞培豁上清BNP抗体，筛选出BNP抗体阳性的杂交瘤蛹胞以有限稀释法难克隆培养。连续透行三次亚克隆，簿逸垂最

4、终呈单充淹生长、稳定分泌BNP抗体的细胞株，选取一株行染色体核型分析。扩大培养分泌BNP单克隆抗体的细胞株，以5x10’．1x106个细胞／只搂种于一周前腹胃窘注射0．5m1／只液体石蜡油的Batb／c小鼠。接种后7天开南亲医科丈学硕士学位论文始收集腹水，间接ELISA检测膜水BNP抗体滴废，所得腹水用臻白A亲和层析柱纯化单抗，对得到单克隆抗体进行分析、鉴定。结慕：合成品BNPSDS．PAGE申鬣一单一条带，分子量大·{、舞4kDa。经免疫的Balb／c小鼠血清BNP抗体滴度大于l：104。融合

5、细胞在HAT、HT选择性培养液中培养，非杂交瘸细胞7天内均死亡，仅杂交瘸细胞可以生长并形成细胞克隆。融合后缀筛选、连续三次救克隆，得到三拣稳定分泌BNP统俸的单克滏细胞栋(6E6、6D2、6A9)。染色诲孩登分析表明，其中6E6细胞株的染色体为102条，且可见脾细胞以及SP2／0细胞的特征染色体。扩大培养杂交瘤细胞后腹腔注射小鼠生成腹水，经ELISA验测腹水BNP摭体滴度为1：105。蛋白A亲乖层折纯4艺-S-株单抗腹水，分裁得到2舀、15、6mg褥单克瀣撬体。亚型分析漫示，三株单抗免疫球簧白均

6、为IgGl烈。三株单抗SDS．PAGE分析显示辍链分子量约为27kDa，重链约为51kDa。Western—Blot证实制备所得单抗可特异识别BNP，而对BSA无反应，并且其中6E6椿单抗可特异识别人心肌匀浆中的BNP。结论：成功获得三株稳定分泌抗人BNP单克隆抗体镌细胞株，裁务越獍人BNP的单克除抗体。荧键词：脑钠肽单克隆抗体南京匡辫大学碛士学位论支PreparationofmonoclonalantibodiesagainsthumannatriureticpeptideBackground

7、：Heartfailureisthefourthcauseofdiseaseinadulthospitalization，whichbringsgreatthreattothehumanhealth．SincethepeptideofBrainNatriuretricPeptide(Bye)wasfound，thevalueofplasmaBNPconcentrationastheindicatorindiagnosisandprognosisofheartfailurehasbeenconfi

8、rmed．TheimportanceofBNPmeasurementwasemphasizedintheguidelineofheartfailureissuedbyESCandACC／AHA．Now，BNPbecomesthepotentialbiomarkerindiagnosis、riskstratificationandprognosisevaluationofheartfailure。Aims：ToobtainthehybridomasecretingBNPmonoclonalanti