Puro双标干涉慢病毒系统的构建及对细胞凋亡的影响-论文.pdf

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1、JSouthMedUniv,2013，33(12)：1761—1765·工76工·基础研究细胞角蛋白8GFP／Puro双标干涉I曼病毒系统的构建及对细胞凋亡的影响金延超，尹荣华，郑巍薇，孔祥祯，詹轶群，杨晓明，李长燕天津大学制药工程系，天津300072；军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850摘要：目的构建细胞角蛋白8(cK8)的双标慢病毒干涉载体，获得高滴度慢病毒颗粒，感染HCT116细胞建立稳定株，检测CK8敲低对细胞凋亡的影响。方法将CK8的siRNA序列插入慢病毒表达载体GV248，并与包装

2、质粒PMD、SPA共转染293T细胞，36、48h分两次收集慢病毒上清，应用流式细胞术检测病毒滴度。获得的病毒感染HCT116细胞，用嘌呤霉素筛选阳性细胞，Westernblotting检测干涉效果。采用AnnexinV／PI染色检测干涉CK8对化疗药物顺铂诱导的细胞凋亡的影响。结果与结论成功构建CK8干涉慢病毒载体并得到干涉稳定株，在HCT116细胞中干涉CK8使细胞对顺铂引起的凋亡更加敏感。关键词：细胞角蛋白8；GFP／Puro双标慢病毒；RNAi；凋亡；J『l白ConstructionofaGFP／Pur

3、odouble—labeledlentiviralvectorcontainingCK8interferingRNAanditseffectoncellapoptosisinvitroJINYanchao，YINRonghua2,ZHENGWeiwei2，KONGXiangzhen，ZHANYiqun2,YANGXiaominf,LIChangyanDepartmento／PharmaceuticalEngineering,TianjinUniversity,Tianjin300072，China；Instit

4、uteodRadiationMedicine,Academyo／MilitaryMedicalSciences，Beijing100850,ChinaAbstract：ObjectiveToconstructaGFP／Purodouble—labeledlentiviralexpressionvectorforCK8silencingandassesstheeffectsofCK8silencingoncellapoptosis．MethodsThesiRNAsequencesofCK8wereinserted

5、intothelentiviralexpressionvectorGV248andtransfectedinto293TcellswiththepackagingplasmidsPMDandSPA．Thelentiviruswascollectedat24and36hpost—transfection．Flowcytom6trywasusedtodetectthevirustiterandthepositivecellswereselectedwithpuromycin．TheknockdownofCK8was

6、examinedbyWesternblotting．TheeffectofCK8down—regulationoncellapoptosisinducedbycisplatinwasdetectedwithAnnexinV／PIstaining．ResultsandConclusionWesuccessfullyconstructedCK8interferencelentiviralvectorandobtainedastablecell1inewithCK8knock-downthatwassensitive

7、tocisplatin．inducedapoptosis．Keywords：CK8GFP／Purodouble—markerlentiviralvector；RNAinterference；apoptosis；cisplatin细胞角蛋白是上皮细胞中间丝蛋白的重要组成部CK8中间纤维在发育及肿瘤发生过程中调控上皮细胞分，亚型I(K9．K28)和亚型II(K1．K8和K71．K80)组成粘附及运动]。不同上皮来源的肿瘤细胞中CK8的持了细胞角蛋白家族]。其中CK8／18组成的二聚体是单续表达是其侵袭特f生的标志。

8、CK8在很多肿瘤细胞中层上皮细胞中中间纤维的主要成分，在胃肠道、肝脏、胰的表达异常，可以作为初步判断某些肿瘤的标志。对腺外分泌、乳腺等癌症易发部位分布。CK8定位于细胞CK8敲除小鼠的研究表明CK8参与炎性肠病的发生。浆中，由483个氨基酸组成，分为3个功能结构域，即头纯合的FVB／N小鼠大约有一半的纯合小鼠存活，存活部结构域(N端)、杆状结构域和尾部结构域(c端)。其的纯合母鼠不孕，