mda7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

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1、MDA7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响【摘要】构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒，并初步探索其抗肿瘤活性。方法：通过基因操作技术将启动子（hTERTp）+目的基因(MDA7)插入到5型腺病毒E1A区域，构建复制缺陷型腺病毒AdTPmda7；同时构建对照病毒AdTPEGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA7在肿瘤细胞株中的表达状态；通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果：成功构建携带目的基因的腺病毒载体，PCR鉴定正确；蛋白质印迹结果表明MDA7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达

2、,诱导肿瘤细胞凋亡，如A549，SGC7901等，在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时，原代细胞中没有检测到MDA7表达；结晶紫染色试验结果表明AdTPmda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTPEGFP。结论：成功构建复制缺陷型腺病毒AdTPmda7，并证实MDA7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。【关键词】复制缺陷型腺病毒端粒酶启动子肿瘤基因治疗［Abstract］Objective:TodevelopaproliferationdeficientadenovirusforgenetherapyinwhichthehTERTpromot

3、erwasintroducedtoregulatetheexpressionofthetarget11geneintumorcells.Methods：Atumorspecificproliferationdifficientadenovirusvectorwasconstructedbyemployingthehumantelomerasereversetranscriptase(hTERT)promotertodrivetheexpressionofadenovirusmediatedtargetgene;atthesametimeAdSuTPEGFPwasconst

4、ructedascontrol.TiterwasobtainedbyTCID50method.TheexpressionofMDA7wasdetectedbywesternblotandtheappearanceofsenescencewasassessedbyvioletstaining.Cellswerephotographed2hafterstaining.Results：TwoadenovirusvectorsincludingtargetgeneweresuccessfullyconstructedandidentifiedbyPCRtechnology.Wester

5、nblotanalysedthatMDA7selectivelyexpressedintumorcelllinesMHCC,SGC7901,A549,andsoon,andinducedapoptosis，whileprimarylungfibroblastwastransducedatequalMOIlevelanddidnotexpressdetectablelevelsofMDA7;violetstainingtestverifieddirectlythatkillingeffectofAdTPmda7wasgreatstrongerthanAdTPEGFP，sup

6、portingthatoneofthefunctionsofMDA7wasapoptosisinduction.Conclusion：proliferationdeficientadenovirus,AdTPmda7,wassuccessfullyconstructed,simultaneouslyverifiedthattheoverexpressionofMDA7intumorcellsinducedtumorcellapoptosis,whichwasanovelgenevirustherapeuticsystemandsignificantfortargeted

7、tumorgene11therapy.［Keywords］replicationdeficientadenovirus；telomerasereversetranscriptase（hTERT）promoter；tumortargetedgenetherapy黑色素瘤分化相关基因7（MDA7），是1995年由哥伦比亚大学Jiang等［1］通过差减杂交方法从干扰素和瑞香素诱导的终末分化的人黑色素瘤细胞HO1中分离获得的一种新基因，具有肿瘤抑制因子和细胞因子活性。2001年