凋亡素基因重组腺病毒的构建.doc

《凋亡素基因重组腺病毒的构建.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、凋亡素基因重组腺病毒的构建【摘要】目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体，为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrackCMVVP3，然后电转化到BJ5183AD1细胞中进行同源重组。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA，然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒，运用RTPCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果PacⅠ酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力，RTPCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的

2、编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109VP/ml，滴度为6.561×109PFU/ml。结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒，它的滴度足以满足体内外实验。【关键词】凋亡素基因腺病毒载体基因治疗【Abstract】ObjectiveToconstructarecombinantadenoviruscarryingApoptingenesoastoprovidebasisforfurtherstudyingApoptingenefunctionsandascertainingcorrespondingmechanism.MethodsTheshutt

3、levectorpAdTrackCMVVP3containingApoptingenewaslinearizedwithPmelandsubsequentlyelectrotransformedintoBJ5183AD1cellsforhomologousrecombination.TheDNAcontainingApoptingeneoftherecombinantadenoviruswasobtainedbydigestingwithPacIandthentransfectedinto293cells,wheretherecombinan

4、tadenoviruscontainingApoptingenewasidentifiedbyRTPCRandpurifiedbycesiumchoridedensitycentrifugation.Finally,thetitreoftherecombinantadenoviruswasdeterminedbybiologicalandphysicalassays.ResultsDigestionwithPacIprovedsuccessfulhomologousrecombination.Greenfluorescenceshowedsucce

5、ssfulrecombinantadenoviruswithinfectiveness.RTPCRconfirmedthattherecombinantadenovirushadcodingofApoptingeneproteins.Thetitreoftherecombinantadenoviruswas84.52×109VP/mland6.561×109PFU/ml.ConclusionTherecombinantadenovirusvectorcontainingApoptingeneissuccessfullyconstructed,wit

6、hitstitresufficientforinvivoandinvitroexperiment.【Keywords】Apoptingene;Adenovirusvector;Genetherapy凋亡素，又称Apoptin(apoptosisinduction)［1］，是来源于鸡贫血病毒(chickenanemiavirus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发一些肿瘤细胞凋亡和细胞转化，而对正常细胞无此作用。在肿瘤的治疗上具有巨大潜力［1］。由于凋亡素是外来物质，在发挥作用前必须进入细胞，所以我们选择腺病毒作为载体来运载它，以期能探索它的作用机制，为

7、肿瘤的治疗提供新的途径。1材料与方法61.1含凋亡素基因的穿梭质粒PAdtrackCMVVP3的获得［2］我们已经成功构建了含凋亡素基因的穿梭质粒，并且通过了酶切和测序鉴定，为下一步实验的进行奠定了基础［2］。1.2含凋亡素基因的腺病毒基因组(PAdVP3)质粒的构建1.2.1同源重组pAdTrackCMVVP3用Pmel酶切，线性化，再用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)进行去磷酸化处理，最后电转化(BioRadGenePulserElectropoerator2500V200Ωmax)到BJ5183AD1

8、细胞中，与其内的pAdEasy1进行同源重组。设置阴性对照组为空载体pAdTrackCMV，经过以上处