携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

《携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达作者：陈闽何姜刘小莺黄敬泽王林曦刘礼斌【摘要】　　目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体，为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1，并将其定向克隆于真核表达载体pDC315EGFP，与辅助质粒pBHGlox⊿E1，3Cre共转染HEK293细胞，经位点特异重组包装得到重组腺病毒AdAPM1。通过RealtimePCR和1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒AdAPM1包装成功，病毒滴度>6.3×1012pfu/m

2、L。RealtimePCR和1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。【关键词】胞间信号肽类和蛋白质类基因转染腺病毒科　　脂联素亦称Acrp30(30KDa脂肪补体相关蛋白)、GBP28(28KDa凝胶结合蛋白)、APM1(脂肪组织最丰富的基因转录产物)等，是由Scherer等人于1995年从诱导分化的鼠脂肪细胞中最早发现的具有244个氨基酸的多肽[1]。由于其具有改善胰岛素抵抗、促进血浆游离脂肪酸氧化、抗动脉粥样硬化等作用而成为近年研究的热点[24]。本研究旨在体外构建人脂联素基因腺病毒载体及检测其表达，为进

3、一步研究脂联素的功能及调控机制提供实验基础。　　1材料和方法　　1.1主要试剂及仪器内切酶EcoRI、SalI(美国NEB公司)，T4DNAligase(美国NEB公司)，Taqpolymerase(日本Takara生物公司)，dNTP(美国Promega公司)，Plasmid抽提Kit(德国QIAGEN公司)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)，携带人脂联素基因的质粒pINCYAPM1(美国OpenBiosystems生物公司)，MouseantiFlag抗体(美国Sigma公司)HEK

4、293细胞(美国ATCC公司)，真核表达载体pDC315EGFP(上海吉凯生物公司)，辅助包装质粒pBHGloxΔE1，3Cre(加拿大Microbix公司)，PCR仪(美国AppliedBiosystems公司)，RealtimePCR仪(美国BioRad公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，电泳仪(美国BioRad公司)。引物(中国吉凯公司合成)。　　1.2方法　　1.2.1腺病毒穿梭质粒pDC315APM1的构建及鉴定以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应克隆人脂联素基因APM1，随后以EcoRI、SalI双酶切聚合酶链

5、反应扩增产物及真核表达载体pDC315EGFP，纯化酶切产物后进行定向连接，转化大肠杆菌感受态细胞，铺板，将长出的克隆通过PCR和测序鉴定。　　人脂联素cDNA片段引物(778bp，用于PCR获取目的基因，有下划线的24个碱基序列代表flagtag序列，PCR产物片段长)：　　上游：5’CCGGAATTCATGCTGTTGCTGGGAGCT　　G3’　　下游：5’ACGCGTCGACTCACTTGTCATCGTCAT　　CCTTGTAGTCGTTGGTGTCATGGTAGAGAAG3’　　用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落的引物(477bp，

6、上游引物的设计位于基因内部，下游引物设计位于载体)：　　上游：5’GTAAAGCGAATGGGCATG3’　　下游：5’ACGTGGGTATAAGAGGCG3’　　1.2.2重组腺病毒AdAPM1的包装HEK293细胞转染前1天传代，使得转染时细胞汇合率为50%～60%，采用脂质体法将腺病毒穿梭质粒pDC315APM1和辅助质粒pBHGlox⊿E1，3Cre双质粒共转染HEK293细胞，待大部分细胞出现细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)后低速离心收集细胞，并重悬于2mLPBS中，-70℃/37℃反复冻融，振荡3次，;离心收集上清

7、，此成为病毒原液，-80℃保存。　　1.2.3重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定取上述病毒原液重新感染HEK293细胞，待大部分细胞CPE完全形成后，收集细胞，PBS重悬，冻融细胞，离心收集上清，-80℃保存。按AdenXTMvirusPurificationKit(BDBiosciences，Clontech)的步骤纯化重组腺病毒。采用终点稀释法对腺病毒滴度进行测定，公式：　　病毒滴度=10(x+0.8)(pfu/mL)　　1.2.4重组腺病毒的鉴定　　1.2.4.1腺病毒感染检测取包装过程中的转染后第12天的细胞培养上清液，10000r/min离心1min，

8、吸出上清液加入到6cmd